Окраска по Граму

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (предложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознавательных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристалл-виолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грам+). Например, спорообразующие бактерии родов - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам+ бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан-виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам- бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопротиидов и липополисахаридов. Грам- бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам+ отличаются от грам- не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам+ видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам-бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам+ в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.

Окраска по Граму проводится следующим образом:

1. На одном предметном стекле готовят три мазка из бактериальных культур: заведомо известной Грамположительной, исследуемой и заведомо известной Грамотрицательной.

2. Мазки высушивают и фиксируют пламенем.

3. Окрашивают карболовым раствором генциан-виолета в течение 1-2 мин.

4. Краску удаляют стряхиванием, на мазки наносят раствор Люголя (раствор J и КJ) и выдерживают 1-2 мин. до почернения мазка.

5. Сливают раствор Люголя и на препарат наносят несколько капель 96% спирта и слегка покачивая стекло, выдерживают его до осветления мазка. (20-30 сек).

Препарат немедленно промывают водой. От обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработку все бактерии сохраняют окрашивание, при излишней – все клетки обесцвечиваются.

6. Дополнительно окрашивают препарат фуксином Пфейффера (разведенный фуксин) в течение 2 мин.

7. Краску смывают, препарат подсушивают и смотрят с иммерсионным объективом 90х.

Если препарат приготовлен правильно, то в поле зрения видны грам + темно-фиолетовые клетки и рядом с ними хорошо различаются бледно-розовые грам- клетки.

Дата добавления: 2015-06-27