Екстракція білків

Діаліз

Осадження

Гравіметричним аналізом називають метод кількісного хімічного аналізу, заснований на точному вимірі маси визначуваної речовини або його складових частин, що виділяються у вигляді сполук точно відомого постійного складу. Гравіметричні визначення можна розділити на три групи: методи осадження, відгонки і виділення. Серед гравіметричних методів аналізу найбільш широко застосовують метод осадження. Завдання кількісного аналізу - визначення кількісного вмісту хімічних елементів у з'єднаннях.
У процесі утворення осаду розрізняють три основних паралельно протікають процеси:

1) освіта зародків кристалів,

2) зростання кристалів;

3) об'єднання хаотично орієнтованих дрібних кристалів.

У початковий момент змішування реагують компонентів розчин, що містить ці компоненти, перенасичується і утворюються найдрібніші частинки осаду - зародки. Зародок кристала - найменший агрегат атомів, молекул або іонів, що утворюється у вигляді твердої фази при осадженні і здатний до мимовільного зростання. Освіта зародків в пересичені розчини може відбуватися як спонтанно, так і при введенні в розчин твердих частинок осаду, які можуть служити центром освіти зародків. Нерозчинні частки, що містяться в реактивах і розчиннику, також є центром освіти зародків. Час з моменту змішування розчинів реагуючих речовин до появи зародків називають індукційним періодом, тривалість його залежить від концентрації реагуючих речовин, а також від природи осаду. Так, при осадженні сирнистий осаду AgCl індукційний період незначний, а при осадженні кристалічних опадів - досить великий. Зростання кристалів відбувається за рахунок дифузії іонів до поверхні зростаючого кристала і осадження цих іонів на його поверхні і визначається не тільки дифузійними процесами, а й структурою зростаючих кристалів, дефектами кристалічної решітки, впровадженням у неї різних іонів і т. д.

Число і розмір часток осаду залежать від співвідношення швидкості утворення зародків кристалів і швидкості росту кристалів. Якщо швидкість утворення зародків кристалів мала в порівнянні зі швидкістю росту кристалів, утворюється невелика кількість великих часток - осад крупнокристалічний, при зворотному співвідношенні швидкостей виходить мілко дисперсний осад, що складається з великого числа дрібних частинок. Швидкості обох процесів залежать від відносного перенасичення розчину, що визначається виразом:

Відносне пересичення = (C-S) / S,

де C - концентрація осаджуваної речовини в розчині, що отримується в момент внесення осадника; S - розчинність.

Висолювання

Висолювання високомолекулярних сполук — процес виділення в осад розчиненої ВМС шляхом додавання електролітів. Висолювання обумовлене зниженням розчинності ВМС при введенні електролітів. Висолювання принципово відрізняється від явища коагуляції золів електролітами. Коагуляція золів відбувається при введенні порівняно невеликої кількості електроліту і є необоротним процесом. Висолювання ВМС — оборотний процес, після видалення з осаду електроліту ВМС знову можна розчинити з утворенням істинного розчину. Механізми цих явищ різні. Коагуляція золів відбувається в результаті стиснення подвійного електричного шару і зменшення чи зникнення електричного заряду на поверхні колоїдної частинки. Виділення ВМС з її розчину за допомогою електроліту пояснюється зменшенням їх розчинності ВМС у розчині електроліту. Частина молекул розчинника, яка була у сольватному зв’язку з макромолекулами ВМС, сольватує молекули введеного електроліту. Таким чином, висолююча дія солі полягає у її сольватації за рахунок десольватації молекул ВМС. За висолюючою дією катіони та аніони утворюють ліотропні ряди, що відповідають ступеню їх гідратації:

Li+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+

SO42– > Cl– > NO3–> Br– > I– > CNS–.

Чим більше іон здатен зв’язувати розчинник, тим більшу висолюючу дію він має. Висолювання лежить в основі одного з методів фракціювання ВМС. Використовуючи солі, зазвичай сульфат амонію або сульфат натрію у різних концентраціях, осаджують фракції білків з різною мол. м., які мають різні фізіологічні властивості. Напр., при нижчих концентраціях солі осаджуються глобуліни, при вищих — альбуміни.

Висолювання білків використовують у медицині при проведенні аналізу сироватки крові, а також у фармації при виготовленні лікувально-профілактичних сироваток.
Висолювання білків залежить також від рН середовища. При зміщенні від ВЕТ зростають заряд і гідратація макромолекул білка, підвищується їх розчинність, тому при висолюванні рН підтримують близьким до ВЕТ. Висолювання - процес оборотний. При додаванні води до осаду білка він знову переходить у розчин. Інший фактор, що знижує стійкість розчинів ВМС - це додавання рідини, яка змішується з розчинником, але не розчиняє ВМС. Тому ВМС або випадає в осад, або виділяється у вигляді другої рідкої фази (коацервація). Коацервати, наприклад, можуть бути отримані з водних розчинів желатину додаванням спирту, в якому желатин розчиняється.

Розчинність білків зменшується також при зниженні температури.
Висолювання білків концентрованими розчинами солей - один з методів фракціонування білкових сумішей на альбуміни і глобуліни. На тонкому поєднанні дії солей, спирту і охолодження до -5 º засновані спеціальні способи детального фракціонування білкових сумішей. Цим методом із сироватки крові виділено понад 10 білків.

До висолювання непридатне правило Шульце-Гарді, тому не можна ототожнювати висолювання з явищем звичної електролітної коагуляції. На відміну від гідрофобних золей явище висолювання високомолекулярних речовин не пов'язане з дзета-потенціалом колоїдних міцел і полягає у порушенні сольватного (гідратного) зв'язку між макромолекулами полімеру і розчинником, тобто, в пониженні розчинності полімеру. При введенні солі частину молекул розчинника, яка була в сольватному зв'язку з макромолекулами ВМС, сольватує молекули введеної солі. Чим більше буде введено солі, тим більше число молекул розчинника покине макромолекули полімеру і сольватує сіль. Таким чином, що висолююча дія солі полягає в її власній сольватації (гідратації) за рахунок десольватації (дегідратації) молекул високомолекулярних сполук. Численні дослідження показали, що всякі сполуки, здатні сольватувати розчинником даного ВМС і знижувати його розчинність, буде придатним для висолювання. Так, спирт і ацетон здатні відмінно висолювати желатину з її водних розчинів. Аналогічно відбувається осадження спиртом білка з водного розчину або осадження ацетоном каучуку з розчину бензолу. Враховуючи механізм осаждаючої дії електролітів і інших десольватуючих речовин, Кройт в свій час запропонував загальну схему осадження високомолекулярних речовин, яка представлена на рис. 1. З цієї схеми видно, що для осадження макромолекул необхідно видалити водну оболонку (спиртом або іншою дегідратуючою речовиною) і зняти заряд її шляхом додавання електроліту.

Рис. 1. Схема коагуляції (за Кротом)

При отриманні колоїдних розчинів за допомогою різних методів, особливо за допомогою хімічних реакцій, є неможливим використовувати еквімолярні співвідношення реагентів. З цієї причини в золях може бути присутна надмірна кількість електролітів, що в значній мірі знижує стійкість колоїдних розчинів. Приготовлений будь-який спосіб колоїдний розчин може містити, крім електролітів, інші речовини, наприклад стабілізатори, ВМВ і т.д. Всі ці домішки можуть міститися в колоїдному розчині також у наслідок забруднення вихідних продуктів або з інших причин:

1. Внаслідок взаємодії металів з водою і гідролізу солей утворюються при використанні диспергаційного методу отримання золів - електророзпилення.
2. Внесення електроліту при використанні пептизації опадів електролітами.
3. Часткове розчинення (дисоціація) осаду при використанні пептизації промиванням.
4. Внесення електролітів при використанні хімічної пептизації.
5. Внесення ПАР при пептизації ними.

Як можна помітити, всі види небажаних домішок представлені в основному низькомолекулярними речовинами, а тому очищення колоїдних систем переслідує своєю метою звільнення колоїдних систем від низькомолекулярних домішок.

Діаліз є найпростішим методом очищення колоїдних систем. Діаліз - це видалення з колоїдних розчинів і розчинів полімерів низькомолекулярних речовин, здатних проникати через деякі природні (бичачий міхур, рослинний пергамент) і штучні (целофан, колодій) мембрани. Очищення колоїдних методом діалізу полягає втому, що за допомогою напівпроникною перегородки (мембрани) колоїдні міцели можуть бути відокремлені від домішок розчинених у дисперсійному середовищі низькомолекулярних речовин. При діалізі молекули розчиненого низькомолекулярного речовини проходять через мембрану, а колоїдні частинки, нездатні діалізувати (проникати через мембрану), залишаються за неї у вигляді очищеного колоїдного розчину. Явище діалізу для колоїдних систем можливе завдяки тому, що розмір міцел набагато більше розміру молекул низькомолекулярних речовин. Прилади для діалізу називають діалізаторами.

Найпростіший з них – діалізатор Грема. Для проведення Д. між дисперсною системою і розчинником, частіше очищеною водою, розміщують пористу перегородку — мембрану, пори якої проникні для іонів і молекул низькомолекулярної речовини і непроникні для частинок дисперсної фази. Метод ґрунтується на законах дифузії. Природні перетинки (бичачий та свинячий міхур) і штучні плівки із нітро- та ацетилцелюлози, целофану та інших тонкопористих матеріалів використовують як мембрани. При виборі матеріалу для мембрани потрібно враховувати, що вона може отримати заряд унаслідок вибіркової адсорбції одного з іонів електролітів, які містяться у дисперсному середовищі системи, а також за рахунок поверхневої дисоціації функціональних груп речовини мембрани. Заряд мембрани може викликати деякі ускладнення в процесі дифузії домішок при Д. та сприяти зворотній дифузії.

Рис. 2. Діалізатор: a — дисперсна система; б — дистильована вода

Існує багато різновидів діалізаторів, але всі вони побудовані за загальним принципом: система, що діалізується (внутрішня рідина), міститься в посудині, відокремленій перетинкою (мембраною) від розчинника (зовнішня рідина), що міститься в іншій посудині. У конструкції діалізатора повинна бути передбачена можливість частої або безперервної зміни розчинника (діалізату), перемішування внутрішньої рідини (діалізної системи), максимально можлива (велика) площа перетинки, все це сприяє підвищенню швидкості діалізу (прискорює процес дифузії). Діаліз може бути значно прискорений при накладанні електричного поля. Цей процес називається електродіалізом. Електродіалізатор (рис.3.) розділяється двома мембранами на три камери. В середню камеру вміщують дисперсну систему, а в бокові — воду з електродами. Під дією електричного поля відбувається перенос катіонів із середньої камери в катодну камеру, аніонів — в анодну камеру. При цьому розчин у середній камері очищується від домішок електролітів.

Рис.3. Електродіалізатор: a — дисперсна система; б — дистильована вода

Ультрафільтрація — це фільтрування під надлишковим тиском крізь ультрафільтр, виготовлений із напівпроникної мембрани. Ультрафільтрація використовується не тільки для видалення низькомолекулярних домішок, але й для концентрування систем. Застосування мембран з певним розміром пор дозволяє розділити дисперсну фазу на фракції за розмірами частинок і визначити ці розміри. Так були знайдені розміри деяких вірусів і бактеріофагів. Нерідко застосовують комбіновані методи очищення. Прикладом сполучення діалізу з ультрафільтрацією є апарат «штучна нирка», призначений для тимчасової заміни функції нирок при гострій нирковій недостатності. Апарат підключають до системи кровообігу хворого, кров під тиском протікає між двома мембранами, які омиваються ззовні фізіологічним розчином. З крові порівняно швидко видаляються шлаки — продукти обміну і розпаду тканин. Комбінацією ультрафільтрації та електродіалізу є електроультрафільтрація, яка застосовується для очищення і розділення білків.

Перевагою електродіалізу перед звичайним діалізом є мала кількість часу, необхідне для очищення (хвилини, години).

Слід зазначити, що електродіаліз особливо ефективний тільки після попереднього очищення за допомогою звичайного діалізу, коли швидкість дифузії через падіння градієнта концентрації електролітів між золем і водою мала і можна застосовувати електричне поле великої напруги, не боячись сильного розігрівання золю.

Переведення білків у розчинний стан. Як правило гомогенізація супроводжується екстракцією білків. Для цього використовують:
– розчини солей – більшість білків добре розчиняються в 8 – 10% розчинах солей;
– органічні розчинники – водні розчини гліцерину, розчини сахарози, етанол, ацетон (майже всі органічні розчинники розривають білок-ліпідні зв’язки);
– деякі детергенти (ПАВ) – порушують гідрофобні взаємодії поміж білками та ліпідами, а також поміж білковими молекулами. Зокрема, для екстракції білків із біологічних мембран використовують тритон Х-100, додецилсульфат натрію та дозексихолат натрію. Сучасні методи подрібнення тканин зазвичай поєднують з одночасною екстракцією білків з гомогенатів тканин. Більшість білків тканин добре розчинна у 8-10% розчинах солей. При екстракції білків широко застосовують різні буферні суміші з певними значеннями рН середовища, органічні розчинники, а також неіонні детергенти - речовини, що руйнують гідрофобні взаємодії між білками і ліпідами і між білковими молекулами. З органічних сполук, крім давно застосовуваних водних розчинів гліцерину, широко використовують слабкі розчини сахарози. На розчинність білків при екстракції великий вплив робить рН середовища, тому в білкової хімії застосовують фосфатні, цитратні, боратні буферні суміші зі значеннями рН від кислих до слабо лужних, які сприяють як розчиненню, так і стабілізації білків. Для виділення білків сироватки крові використовують способи їх осадження етанолом (див. Метод Кона), ацетоном, бутанолом та їх комбінації. Майже всі органічні розчинники розривають білок-ліпідні зв'язку, сприяючи кращої екстракції білків. Для отримання з біологічного матеріалу білків в чистому, гомогенному, стані застосовують різні детергенти, що сприяють розщепленню білок-ліпідних комплексів і розриву білок-білкових зв'язків. Зокрема, для звільнення білків (ферментів), міцно пов'язаних з біо-мембранами мітохондрій або інших субклітинних структур, застосовують тритон Х-100, додецилсульфат натрію і дезоксихолат натрію.

Лабораторне обладнання для екстракції білків

Рис. 1.1. Лабораторне обладнання.

а - маточний річний гомогенізатор: 1 - товкач, 2 - корпус, 3 - мотор, 4 - штатив; механічний гомогенізатор (б) і кульова млин (в): 1 - корпус з електродвигуном і пусковим пристроєм, 2 - камера для подрібнення матеріалу.

Слід, однак, мати на увазі, що детергенти, викликаючи розрив білок-білкових зв'язків, руйнують олігомерних (четвертинну) структуру білків.

Дата добавления: 2017-01-14