Общая характеристика и номенклатура стволовых клеток

Стволовые клетки это клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в другие типы клеток.

СК характеризуются наличием трёх главных свойств:

- СК ассиметрично делятся, т.е. при пролиферации СК вместо образования 2-х одинаковых дочерних клеток одна – дочерняя клетка становится коммитированной (commit – поручать, вверять), способной стать более специализированной, а другая – остаётся неспециализированной СК;

- СК способны к самообновлению, т.е. репопулируют (пролиферируют без дифференцировки) на протяжении неопределённо длительного периода времени или даже в течение всей жизни организма (long-term subset);

- СК могут дифференцироваться в специализированные типы клеток (по крайней мере в клетки 2-х различных фенотипов), проходя стадию прогениторных клеток (progenitor- предшественник) из так называемого краткосрочно существующего пула неспециализированных коммитированных СК.

По происхождению различают 2 группы СК – эмбриональные и региональные. Потенции генома этих клеток существенно различаются по свойствам и ассортименту воспроизводимых ими специализированных клеток.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – возникают на разных стадиях развития зародыша и представляют собой клетки с тотипотентными или плюрипотентными свойствами. Именно эти клетки являются истинно стволовыми клетками в организме. На 2-4 сутки развития зародыша (стадия морулы) формируются тотипотентные стволовые клетки, которые в условиях in situ способны развиваться до стадии взрослого организма (однояйцовые близнецы).

Оплодотворённую яйцеклетку – зиготу – также относят к тотипотентным СК, поскольку эта клетка воспроизводит все органы эмбриона и необходимые для его развития экстраэмбриональные структуры: хориональную часть плаценты, пуповину и др.

Между тем, для биоэтически допустимых экспериментов, а также для получения и сохранения в лабораторных банках тотипотентных ЭСК используют не зиготы, а клетки- дублёры зиготы. Эти клетки получают лабораторным способом в обход процессов полового оплодотворения и беременности путём переноса ядра, из какой либо аллогенной («чужеродный», соматической клетки в зрелую донорскую клетку, из которой предварительно был удалён собственный пронуклеус (получение цитогибридов).

Обычно же ЭСК выделяют из эмбриобласта на 5-7 сутки развития человеческого зародыша (стадия бластоцисты). Эти клетки плюрипотентны и представляют собой группу зародышевых клеток (около 80-100 клеток) являющихся зачатком всех будущих специализированных клеток. Клетки эмбриобласта способны дифференцироваться во все типы клеток, производные всех трёх эмбриональных зародышевых листков, образовывать любые ткани организма, но не целый организм, поскольку эти клетки не участвуют в образовании экстраэмбриональных структур (плаценты, пуповины др.).

ЭСК характеризуются высоким уровнем экспрессии теломеразы, а также выработкой специфического транскрипционного фактора Okt-4, который необходим для поддержания фенотипа ЭСК. И играет ведущую роль в детерминировании ранних этапов эмбриогенеза и дифференцировки.

Для ЭСК человека характерно также наличие на поверхности мембран ранних эмбриональных антигенов – SSEA-3 b SSEA-4, TRA-1-60, TRA-81, которые позволяют идентифицировать репопуляционную активность этих клеток.

В более позднюю фазу развития эмбриона (на 5-12 неделе внутриутробного развития) вплоть до рождения из него выделяют более зрелый тип ЭСК, которые называют СК поздних эмбрионов (5-8 недель гестации) или СК плодов (при сроках более 8 недель гестации).

Поскольку поздние зародышевые (фетальные) СК выделяют на стации образования зачатков различных органов, то возможности этих клеток к дифференцировке в различные типы специализированных клеток уже ограничены эмбриональным лепестком их происхождения, а также степенью зрелости (дифференцировки). Именно поэтому поздние зародышевые (фетальные) СК относят уже не к плюритентным, а мульти-и даже унипотентным клеткам, то есть, к клеткам, способным создавать при культивировании лишь ограниченное число клеточных фенотипов.

Мульти- или унипотентность СК поздних эмбрионов, присущиеим свойства хоминга и клеточного херизма, а также отсутствие опастности образования из них эмбриотератом при трансплантации во взрослый организм в отличие от истинных ЭСК, полученных на самых ранних сроках гестации) позволяет рассматривать СК поздних эмбрионов как разновидность региональных СК или СК зрослых органихмов.

2.2. Получение и свойства стволовых клеток

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ)).

ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) официально пока не используются в клинической медицине из-за морально-этических и правовых проблем, связанных с прекращением развития человеческих зародышей, а также опасности перерождения отдельных популяций этих клеток в злокачественные тератокарциномные опухоли после трансплантации во взрослый организм (25-30% наблюдений по Odorico et al. [64]). Однако, несмотря на это, в ведущих медицинских центрах мира уже более 5 лет не прекращаются интенсивные научные исследования условий выращивания бессмертных линий ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) и их направленной дифференцировки в различные типы соматических клеток, так как технологическая возможность осуществления ген-индуцированной селекции этих клеток делает ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) уникальным потенциальным источником сырья для получения промышленных объемов высокоэффективных очищенных стандартизированных клеточных препаратов. Другими словами, ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) представляют собой новый мощный биоресурс медицины.

Для получения лабораторных линий дифференцированных соматических клеток обычно используют 3 природных источника ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ): бластоцисты человека (4-6 дней гестации), половой зачаток фетусов 4-5- недель развития, а также клетки зародыша на стадии гаструляции (8-12 дней гестации), которые еще поддаются репрограммированию в линии ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ).

Однако основным источником сырья для получения клонов ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) остаются бластоцисты человека после искусственного оплодотворения яйцеклетки в условиях in vitro. Принято считать, что зародыш на стадии бластоцисты представляет собой "стволовую нишу", в которой четко разделены эмбриобласт и поддерживающие его клетки трофобласта, выполняющие роль своеобразного фидера. Клетки трофобласта вырабатывают кофакторы выживания и защиты, которые необходимы для сохранения и пролиферации плюрипотентных клеток внутреннего зародышевого слоя. Одновременно эти клетки блокируют неконтролируемую пролиферацию эмбриобласта (позже эпибласта) in situ. Только малая доля клеток эмбриобласта на этапе бластоцисты сохраняет тотипотентность, так как только 1-2% клеток удается переводить в бессмертную самопроизводящуюся линию ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) [13].

Репрограммирование эмбриобласта в линию ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) начинают с механического отделения эмбриобласта от трофобласта. Затем фрагменты эмбриобласта помещают на "фидер" из фетальных фибробластов без факторов, ограничивающих пролиферацию тотипотентных клеток.

Thomson et al. [77] предложили для выращивания ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) использовать среду Дульбекко над облученным фидером (ингибирована пролиферация фетальных фибробластов) с одновременным добавлением в среду культивирования 3-х ростовых цитокинов – LIF (leukemia inhibitory factor), IL-6, SCF (stem cell factor). Для более активной пролиферации ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) рекомендуется дополнительно использовать FGF-base, EGF, TGF-?.

В последние годы были разработаны методы длительного пассирования ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в течение 1- 2-х и более лет без изменения их гено/фенотипа, причем культуры ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) могли пройти за этот срок более 450 циклов самоудвоения без анеуплоидии и малигнизации. Необходимо подчеркнуть, что рост ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в культуре идет клонами с образованием клеточных агрегатов (эмбриоидные тельца).

Образование эмбриоидных телец начинается с агрегации однородных СК (стволовые клетки), которые пролиферируют и по мере нарастания клеточной массы (клеточности) изменяют состав внутренней локальной микросреды с формированием концентрационных градиентов веществ, которые приводят к изменению экспрессии генов и развитию процессов дифференцировки клеток внутри эмбриоидного тельца. Процесс формирования градиента концентраций веществ протекает динамично по мере нарастания клеток и касается в первую очередь изменений концентраций СО2, NO, O2, глюкозы, а затем состава пептидов и факторов роста. Это в свою очередь меняет характера межклеточных «cell-cell» взаимодействий и ведет к формированию клеток различных по направлению дифференцировки. Когда клеточные агрегаты достигают размеров 50-80 клеток, наступает равновесие между пролиферацией и апоптозом. Спонтанную дифференцировку и гибель клеток обычно предотвращают повторным диспергированием агрегатов.

Дифференцировка ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) наступает после смены среды, удаления фидера и LIF, а также добавления сыворотки, что ведет к прикреплению клеток к подложке, образованию монослоя и формированию их цитоскелета.

Для прикрепления клеток к подложке добавляют не только сыворотку, но и индукторы цитодифференцировки в строго определенных концентрациях, преимущественно белки, которые участвуют в ранних стадиях формирования различных клеточных типов. Для этих целей используют активин А, который индуцирует преимущественно мезодермальную дифференцировку и главным образом образование мышечных клеток (скелетных, кардиомиоцитов); эпидермальный фактор роста, который индуцирует образование мезодермальных и эктодермальных клонов (специфичен для образования клеток кожи); нейрогенный фактор роста, который способствует образованию клонов клеток мезодермы, эктодермы и эндодермы (специфичен для образования клеток печени и эндокринной части поджелудочной железы). При обработке ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) нейрогенным фактором роста и ретиноевой кислотой формируется клеточная популяция, содержащая около 50% клеток, несущих маркеры нервных клеток (окраска антителами к нестину, виментину, polysyalated – NCAM, MAP-2, NeuN, betaIII-tubulin) [13].

Предполагают, что ретиноевая кислота может также выступать в роли индуктора образования мультипотентных мезенхимальных клонов в культуре, которые далее в зависимости от используемых доз и дополнительного набора сигнальных молекул и генов "второго эшелона", определяющих направление цитодифференцировки, воспроизводят адипогенез, миогенез, кардиогенез и т.д.

Экспрессии генов созревания кардиомиоцитов способствует также добавление в среду культивирования ДМСО, который выполняет роль вектора для доставки гидрофобных сигналов (ретиноевая кислота, цитокины с гидрофобными доменами) в ядро ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ). Накопление кислородных радикалов и электрическая стимуляция ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в культуре также ускоряют образование зрелых спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов [48]. Показано [51], что в эмбриональных агрегатах ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) можно добиться также дифференцировки клеток в хондроциты, причем в роли главных сигналов хондрогенеза выступают подобранные концентрации белков BMP-2, BMP-4 и TGF-?, вырабатываемых, как известно, клетками мезенхимы. Фидер OP9 из стромальных клеток, а также VEGF, FGF-? и HGF поддерживают рост эндотелиальных клонов мезодермы.

Показано, что дифференцировка ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в нейроны, кардиомиоциты и клетки других фенотипов (хондроцитов) идет in vitro в среднем 10-15 дней, тогда как аналогичный процесс в зародыше занимает 5-7 дней. Очевидно, это связано с тем, что наработка соматических клеток из ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) идет в обход эмбриогенеза, когда отсутствуют условия для организованного взаимодействия мезенхимы и провизорных клонов клеток всех трех зародышевых листков. В результате только часть событий клеточного и органного морфогенеза хаотически воспроизводится в культуре эмбриоидных агрегатов.

Важно отметить также, что при создании условий дифференцировки клеток в определенном направлении только незначительная часть клеток начинает проявлять свойства заданного фенотипа (не более 1/3). Именно поэтому получение клеток определенного фенотипа пока представляет собой непростую задачу, решение которой осуществляется путем этапных воздействий определенными химическими сигналами на спонтанно формирующиеся эмбриоидные агрегаты ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) (обычно мыши и/или человека) с расшифровкой экспрессирующихся при этом генов, а также путем ген-индуцированной стимуляции дифференцировки в предварительно трансфецированных ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) [13]. Так, стимуляции кардиогенеза в ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) достигают избыточной дозой введенного в клетки гена Nкх-5-2, эритропоэза – избыточной дозой Hох-B4, нейрогенеза - избыточной дозой Neuro-D, миогенеза – MyoD гена. Дифференцировка эмбриоидных агрегатов ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в гепатоциты достигалась введением в клетки гена резистентности к бластоцидину S (антибиотик) под промотор маркерного гена Oct4, а также использованием селективного красителя индоцианина зеленого для отбора колоний появляющихся гепатобластов, которые далее в культуре дифференцируются до кластеров распластанных гепатоцитов. Получениию инсулин- и глюкагон-секретирующих клеток сопутствует осуществление направленной дифференцировки эмбриоидных агрегатов ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в клоны нейральных стволовых клеток, обогащенных нестин+.-клетками, т.к. образование гормон-продуцирующих клеток всегда происходило среди колоний нейросфер и параллельно дифференцировке нейральных стволовых клеток. В результате культивирования в таких условиях 18% нейросфер дифференцировались в инсулин- и глюкагон-секретирующие клетки, а 20% нейросфер – дифференцировалось в клетки с нейрональными и гормон-продуцирующими свойствами одновременно [13].

Так как клетки, образующиеся в процессе дифференцировки ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ), приобретают способность стабильно и длительно сохранять свой фенотип в лабораторных условиях (в отличие от РСК (региональные или взрослые стволовые клетки)), то это свойство искусственно полученных соматических клеток открывает перспективу наработки и хранения терапевтически эффективных доз дифференцированных клеток, а также применения их с лечебными целями.

Так как клетки, образующиеся в процессе дифференцировки ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ), приобретают способность стабильно и длительно сохранять свой фенотип в лабораторных условиях (в отличие от РСК (региональные или взрослые стволовые клетки)), то это свойство искусственно полученных соматических клеток открывает перспективу наработки и хранения терапевтически эффективных доз дифференцированных клеток, а также применения их с лечебными целями.

Например, в опытах на животных уже показано [36,48], что кардиомиоциты, выращенные in vitro из плюрипотентной зародышевой ткани, активно встраиваются в миокард развивающихся зародышей (тканевой химеризм), а также в ишемически поврежденную ткань. Предшественники олигодендроцитов, лабораторно полученные из ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ), при трансплантации стимулируют ремиелинизацию в поврежденном мозге животных [31,58].

Лабораторно полученные бета-клетки снимают гипергликемию у животных с экспериментальным диабетом [73].

Ярко выраженные потенции ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) к репопулированию и дифференцировке в различные типы соматических клеток in vitro и отчетливо выявившаяся возможность осуществления ген-индуцированной селекции ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) являются важнейшими предпосылками для реализации промышленного получения высококачественных стандартизированных клеточных линий клеток заданного направления дифференцировки (получение клеточных препаратов); возможность проведения ген-индуцированной селекции позволяет также устранить условия для появления в культуре недифференцирующихся (онкогенных) клонов клеток, создающих опасность перерождения их в тератокарциномные опухоли при трансплантации.

Технологические достижения последних лет обусловили тот факт, что ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) стали наиболее привлекательным и многообещающим объектом исследований в современной клеточной биологии и медицине [13,29,41].

Между тем, отсутствие удовлетворительного законодательного решения проблем терапевтического клонирования ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) человека как в России, так и других странах мира тормозит изучение клинической эффективности применения предифференцированных ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ), а также препятствует оценке предложенных способов защиты реципиентов от переноса им при трансплантации онкогенных клонов клеток. В результате ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) пока по прежнему остаются только уникальным объектом лабораторных и экспериментальных исследований.

Региональные (взрослые) СК (стволовые клетки).

Региональные СК (стволовые клетки) (РСК), в частности аутологичные СК (стволовые клетки) костного мозга, в отличие от ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ), уже используются в клинике для восстановительного лечения нарушенных функций сердца, печени, а также для устранения дефектов костей [18,25,66,67,74,83] и заживления ожоговых ран [11]. Активное использование РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) для целей регенерационной медицины оказалось возможным благодаря отсутствию правовых ограничений на их применение, доступности получения, онкологической безопасности и иммунологической совместимости этих клеток, т.к. донорами РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) обычно являются сами реципиенты (больные).

В отличие от плюрипотентных ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) – РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) уни-, ди- и мультипотентны. Они имеют сниженную популяционную активность (низкая активность теломеразы) и ограниченный потенциал дифференцировки.

Именно поэтому для РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) в условиях in vitro и in vivo особенно важны сигналы культурального и тканевого микроокружения, под влиянием которых РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) дифференцируются в соответствующие зрелые специализированные клетки, поддерживая стабильность процессов самообновления органов и тканей (физиологическая регенерация). Для некоторых типов РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) (СК костного мозга) доказана их способность к миграции в зону поражения.

Проблемы, возникающие при использовании РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) для клеточной терапии, связаны с тем, что еще недостаточно изучены факторы их дифференцировки in vivo и in vitro: отсутствуют окончательные ответы на вопросы: можно ли повысить пролиферативную активность РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) in vitro для получения достаточных количеств донорского материала и какие сигналы in vivo регулируют процессы пролиферации и дифференцировки этих клеток; кроме того, отсутствуют стандартизированные и не слишком дорогостоящие технологии получения очищенных РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) и не изучены возможности устранения возрастного снижения количеств РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) в органах и их терапевтической эффективности.

Остаются не изученными механизмы реализации терапевтических эффектов РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) в организме, связь биологической активности собственных РСК (региональные или взрослые стволовые клетки), с тяжестью состояния больного, возможность восстановления нарушенных функций необратимо поврежденного органа с помощью тех аутологичных РСК (региональные или взрослые стволовые клетки), которые длительное время находились в организме в условиях ингибирующего воздействия на них факторов развивающегося иммунодефицита и т.д.

Основным источником получения РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) для клеточной терапии служат собственные ткани взрослого человека. Перечень тканей, содержащих СК (стволовые клетки), постоянно расширяется, и в настоящее время включает: костный мозг, периферическую и пуповинную кровь [15,82], головной мозг (зубчатое ядро гиппокампа, обонятельная луковица и субэпиндимальная зона латеральных желудочков) и спинной мозг [75,39], дентальную пульпу, кровеносные сосуды [49,69], СК (стволовые клетки)елетные мышцы (сателлитные клетки) [53], эпителий кожи [72] и пищеварительного тракта [70,72], роговицу, ретину, печень [22,76] и поджелудочную железу [43,85].

Практически наиболее удобными источниками получения РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) из органов взрослого человека являются: костный мозг, периферическая и пуповинная кровь [15,32,79], а также биопсийный материал (глубокие слои носоглоточного эпителия, имеющие нейрональное происхождение, клетки печени, эпителий кишечника и др.).

Поскольку свойства СК (стволовые клетки) поздних эмбрионов и плодов близки к свойствам РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) взрослых организмов (они отличаются более высокой популяционной активностью), то абортный материал также может служить источником получения РСК (региональные или взрослые стволовые клетки), начиная с 5-8-12 недели гестации.

Перед трансплантацией РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) культивируют – освобождают от тканевого балласта и создают условия для клонирования и дифференцировки, так как известно, что выход СК (стволовые клетки) в дифференцировку и направление дифференцировки регулируются сигналами микроокружения и их специфичностью [6].

При культивировании РСК (региональные или взрослые стволовые клетки), как и при культивировании ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ), выявляется общая закономерность выживания клеток в культуре. Она состоит в том, что при создании условий направленной дифференцировки клеток только часть клеток обнаруживает свойства дифференцировки в заданном направлении (это подтверждается особенностями морфологической структуры, гистохимическим или иммуно-гистохимическим выявлением маркерных белков). Остальные клетки (до 2/3 клеточной популяции), образуя структуры кластеров с дифференцированными клетками, относятся к клеткам иного направления развития. Эти клетки имеют общность эмбрионального происхождения с дифференцированными клетками и очевидно, в культуре выполняют функции фидерного слоя. Так, нейроциты в культуре окружены клетками глии, также имеющими эктодермальное происхождение [9,12], миоцито- и кардиомиоцитоподобные клетки окружены фибробластами – клетками мезодермального происхождения [19].

Невозможность выклонировать чистую культуру дифференцированных клеток подтверждает, по нашему мнению, участие РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) в формировании структурной целостности ткани и в создании ее апуд-системы, обеспечивающей адекватное функционирование в ней специализированных клеток.

Неудивительно поэтому, что и в условиях in vitro или при повреждении тканей РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) проявляют свои уни-, ди- или мультипотентные свойства, дифференцируясь в клетки тех тканей, из которых они происходят.

Так, из фракции гемопоэтических СК (стволовые клетки) костного мозга могут быть получены клетки крови и иммунной системы; из фракции стромальных СК (стволовые клетки) костного мозга – другие клетки мезенхимального происхождения: остеобласты, хондроциты, фибробласты, тендоциты, миоциты, кардиомиоциты, адипоциты и др. [46,57,68]; из нейрональных СК (стволовые клетки) могут быть получены различные нейроны (холинэргические, пептидэргические, дофаминэргические, GabA-эргические и др.), а также глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, шванновские – миелинпродуцирующие клетки, клетки микроглии) и клетки наружного (кожного) эпителия [61,80]; из СК (стволовые клетки) печени (овальные клетки) могут быть получены гепатоциты и эпителий желчных протоков [42,56,78]; из СК (стволовые клетки) кишечного эпителия –?,?, и? клетки поджелудочной железы, а также эпителий кишечника [28]; из прогениторных эпителиальных клеток поджелудочной железы – гепатоциты [34], и т.д.

В последние годы РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) стали объектом особенно пристальных исследований. Стали появляться работы, указывающие на способность РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) дифференцироваться in vivo не только в клетки того органа или той системы организма, к которой они принадлежат, но и в клетки других органов и тканей, происходящих даже из другого зародышевого листка. Это свойство РСК (региональные или взрослые стволовые клетки), названное пластичностью [30,52] или трансдифференцировкой [24,54], возбудило надежды на возможность регенерации практически любого поврежденного органа и явилось причиной, теперь уже правда стихающего, бума вокруг уникальности терапевтических свойств этих клеток (источники получения "запчастей" организма). Так, в ряде работ утверждалось, что СК (стволовые клетки) нервной ткани могут превратиться в миоциты и гемопоэтические клетки [40,80], СК (стволовые клетки) печеночной ткани в миоциты [59]; появились утверждения, что гемопоэтические СК (стволовые клетки) костного мозга также могут трансдифференцироваться в СК (стволовые клетки)елетные мышцы [38,44], гепатоциты [54], эпителиальные клетки [52], нейроглию [37], нейроны [30,60], эндотелиальные клетки и кардиомиоциты [45,66] после трансплантации их в соответствующие поврежденные ткани организма. Для доказательства трансдифференцировки гемопоэтических СК (стволовые клетки) использовали клетки костного мозга, которые предварительно маркировали GFP (зеленый флуоресцирующий протеин). После пересадки таких клеток, например, в поврежденный миокард часть кардиомиоцитов становилась меченной этим красителем, и это дало авторам основание утверждать, что произошло превращение клеток костного мозга в клетки сердечной мышцы [66].

Аналогичные сведения приводят Jackson с соавторами (45), которые, вводя облученным грызунам в зону инфаркта фракцию стромальных клеток костного мозга, обнаруживали затем в этих клетках кардиоспецифический белок – тропонин.

Во все увеличивающемся числе работ признается, что при повреждении миокарда, печени, мозга и других органов костный мозг служит поставщиком клеток-предшественников для этих органов, поскольку клетки регенерирующих органов после трансплантации костного мозга приобретают черты донорского фенотипа. Однако остается неясным: какие клетки костного мозга поступают в поврежденные органы и каким путем они участвуют в процессах регенерации – путем трансдифференцировки или путем клеточного слияния (fusion), то есть химеризации (гибридизации) клеток?

В подавляющем большинстве работ последних 2-х лет с помощью молекулярно-генетического метода – RT PCR, позволяющего по специфичности ДНК выявлять индивидуальные (клеточноспецифические) поверхностные маркерные белки, метода FACS (fluorescence-activated cells sorter), цитогенетического метода FISH (fluorescence in situ hybridisation), исключительно точного при наличии различий между кариотипом донора и реципиента, было установлено, что гемопоэтические СК (стволовые клетки) костного мозга участвуют в процессах регенерации не за счет их трансдифференцировки, а преимущественно путем их слияния (химеризации) с клетками поврежденного органа [23,62,63,81].

Следует заметить, что слияние клеток является, по-видимому, одним из распространенных механизмов клеточного выживания в организме. СК (стволовые клетки)лонность к слиянию имеют моноциты, макрофаги (образование гигантских клеток с несколькими ядрами вокруг инородного тела, слияние В-лимфоцитов с дендритными клетками), а также эритроциты. Возникновение "гибридных эритроцитов", имеющих антигенные маркеры и донора и реципиента, рассматривается даже как непременный атрибут HLA-идентичных трансплантаций костного мозга [4]. Гибридные многоядерные клетки (со свойствами и донора, и реципиента) после трансплантации костного мозга обнаруживают также в гепатоцитах регенерирующей печени, в клетках миокарда, в эпителии почки, органах желудочно-кишечного тракта и в эпителии тимуса, что может приводить к толерантности по отношению к донорским клеткам [22,23,27,50,65,71].

Известно, что для реализации процесса гибридизации соматических клеток необходимо: слияние мембран контактирующих клеток, для чего они должны быть обратимо повреждены, а также наличие у контактирующих клеток высокого пролиферативного потенциала. В результате в момент деления таких клеток, когда их ядерные оболочки исчезают, создаются реальные условия для слияния хромосом и образования гибридной клетки [1]. Неудивительно поэтому, что большинство авторов подчеркивает необходимость для гибридизации высокого пролиферативного уровня контактирующих клеток. Именно такие условия возникают при терапии СК (стволовые клетки) костного мозга, которые сами обладают высокой популяционной активностью и которые при введении в ткань пораженного органа вступают в контакт с его регенерирующими клетками.

Особого внимания заслуживает еще одно обстоятельство. Показано, что усиленный синтез ДНК клетками регенерирующих органов сопровождается явлением реутилизации ДНК их клеток другого гистотипа, в частности, из введенных лимфоидных клеток.

Из этих наблюдений можно заключить, что костный мозг, будучи лимфоидным органом, становится донором клеток-предшественников мононуклеарного ряда, ядерный материал которых может принять участие в процессах слияния (химеризации) клеток. Работы последних лет не исключают возможность существования таких механизмов [23,84], так как было показано, что при введении свежевыделенных клеток костного мозга они сливались с соматическими клетками печени, головного мозга и сердца без признаков их трансдифференцировки, но при этом в значительной части трансплантированных клеток (выявлялись по GFP) экспрессировались клетки с антигенами CD45+ (лейкоциты) и в меньшей степени с антигенами CD3+ (Т-лимфоциты); остальные клетки идентифицировались как фибробласты. В работе Balsam et al. [26] было также подтверждено, что фракция долгоживущих гемопоэтических СК (стволовые клетки) (c-kitenz, Lin-c-kit+ и c-kit+Thy1.1lo Lin-Sca-1+), введенная в ишемизированный миокард мышей и выявляемая по GFP, не экспрессирует кардиоспецифические белки, а также маркеры гладко-мышечных или эндотелиальных клеток (?-актинин, коннексин, гладко-мышечный актин). В то же время, эти клетки дифференцируются исключительно в традиционные гемопоэтические клетки, генерируя образование миелоидных (CD45, Gr-1), реже В-лимфоидных (В220) и еще реже Т-лимфоидных (CD3) типов клеток, одно из назначений которых, как известно, участвовать в иммунной регуляции местных восстановительных процессов.

Если все-таки признать существование механизма трансдифференцировки РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) (и, прежде всего, гемопоэтических СК (стволовые клетки) костного мозга) в клетки иного гистотипа, то возникает ряд вопросов, которые требуют специальных ответов.

Один из них состоит в том, почему СК (стволовые клетки), например, нервной ткани, печени, гемопоэтической ткани, "охотно" превращаются в клетки другой ткани и весьма пассивно участвуют в регенерации собственной ткани. Второй вопрос касается способности СК (стволовые клетки) вызывать процесс дедифференцировки и сделать его полным перед трансдифференцировкой. Между тем, с помощью современных методов исследований не удается подтвердить существование механизмов дедифференцировки в клетках регенерирующих органов. Был подтвержден лишь возврат при этом к более ранним стадиям зрелости клеток, без утраты ими своего исходного гистотипа, причем глубина этого процесса при регенерации разных тканей была неодинаковой [5].

Из клетокже костного мозга только лимфоциты способны превращаться в менее зрелые формы – лимфобласты и приобретать утраченную способность к делению. Гемопоэтическая СК (стволовые клетки) по своим морфологическим признакам имеет сходство с малым лимфоцитом и поэтому возможность превращения ее в клетки других тканей требует строгих доказательств, получение которых по-видимому следует ожидать в опытах с культурами клеток.

Имея некоторый опыт работы со СК (стволовые клетки) костного мозга, в том числе с клетками гемопоэтического ряда [18,19] мы подтверждаем их чрезвычайно активную роль в ускорении восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях. Мы однако полагаем, что эту важную роль СК (стволовые клетки) костного мозга реализуют не за счет заместительных, а за счет своих индуктивных и информационных свойств, высокий уровень которых поддерживается в этих клетках уровнем их популяционной (генной) активности и адекватным микроокружением. Использование СК (стволовые клетки) от пожилых доноров и трансплантация их в зоны с глубоким нарушением трофики (развитие фиброза) должно «очевидно» вести к ослаблению их регуляторной роли.

3. Перспективы развития клеточных технологий

Можно утверждать, что современная медицина уже приступила к использованию клеточных технологий для лечения различных заболеваний которые по сути представляют собой аномальное поведение отдельных клеточных популяций в организме и которые могут быть СК (стволовые клетки)орректированы клеточными факторами молодых здоровых клеток.

Главным препятствием на пути внедрения этих технологий в широкую клиническую практику служат 2 обстоятельства: сохраняющихся дефицит ауто- и аллогенного донорского материала с выраженной популяционной активностью (мог бы в значительной мере быть нивелирован использованием ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) и РСК (региональные или взрослые стволовые клетки)), и отсутствие пока убедительных доказательств получения выраженных и пролонгированных клинических эффектов, у больных с хроническими системными и аутоиммунными заболеваниями, нуждающихся в таких результатах.

Для решения проблемы нехватки клеточного биоматериала особые надежды возлагаются на расширенное использование ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) после того как в отдельных странах и в мировом сообществе в целом будут отработаны и согласованы различные этико-правовые аспекты терапевтического клонирования этих клеток, а также будут утверждены консенсусные документы.

Технологическая возможность осуществления длительного (многолетнего) пассирования ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) без анеуплоидии и малигнизации, возможность осуществления ген-индуцированной дифференцировки и безопасной селекции этих клеток превратят ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) в уникальный и неисчерпаемый источник сырья для получения промышленных объемов стандартизированных клеточных препаратов.

Переход к использованию предифференцированных клеток из ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ) по сути позволит полностью решить проблему нехватки высокоэффективных клеточных препаратов в медицине.

Однако, даже при решении этических, правовых и технологических проблем останется необходимость построения рациональной системы применения СК (стволовые клетки) у больных при разных патологических состояниях, с определением показаний и противопоказаний к их применению. Ясно, что такая система должна учитывать новейшую информацию о биологии СК (стволовые клетки) и должна основываться на четких представлениях о механизмах регуляции и дизрегуляции восстановительных процессов в поврежденных органах больного организма.

Эта система должна строиться с учетом понимания причин угнетения активности собственных РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) и торможения механизмов их естественной дислокации (в частности, СК (стволовые клетки) костного мозга) в кровоток и очаги повреждения, а также с учетом понимания механизмов цито- и гистогенеза в поврежденных тканях на уровне межклеточных взаимодействий: донорских СК (стволовые клетки) со здоровыми и поврежденными клетками реципиента. Такие исследования необходимо развивать, особенно интенсивно на этапе доклинического изучения возможностей клеточной терапии предифференцированными РСК (региональные или взрослые стволовые клетки) и ЭСК (ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ).

Список литературы к статье Н.А.Онищенко «Клеточные технологии и современная медицина»

Бабаева А.Г., Курило Л.Ф., Зотиков Е.А., и др. БЭБиМ. 2003. №1. с 86-89.

Берсенев А.В. Крашенинников М.Е. Онищенко Н.А. Вестник трансплантологии и иск. органов. 2001. №2, С 46-53.

Викторов И.В. Сухих Г.Т. Вестник РАМН. 2002. №4 с.24-30.

Зотиков Е.А. Клиническая Лабораторная Диагностика. 2000. №3 с.46-47.

Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Порешина Л.П. 2003., Москва. Изд. Хризостом 110 с.

Малайцев В.В. Богданова И.М. Сухих Г.Т. Архив патологии. 2002. №4 с.7-11.

Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Иванова-Смоленская И.А., и др. Вестник трансплантологии и иск. Органов. 1999. №1, 54-59.

Отеллин В.А. Вопросы нейрохирургии. 1999, №4 с.32-37.

Полтавцева Р.А., Ржанинова Р.А., Ревищин А.В., и др. БЭБиМ. 2001. том 132, №9.с 290-293.

Потапов И.В. Крашенинников М.Е. Онищенко Н.А. Вестник трансплантологии и иск. Органов. 2001. №2. с 54-62.

Расулов М.Ф. Тихоокеанский мед.журнал. 2004, №1 (15), с 7-9.

Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Марей М.В., и др. БЭБиМ.. 2001. Том 132, №9, с 285-289.

Репин В.С., Ржанинова А.А., Шеменков Д.А. «Эмбриональные стволовые клетки: Фундаментальная биология и медицина». 2002, изд. РеМеТекс, Москва, 220 с.

Репин В.С. Сухих Г.Т. «Медицинская клеточная биология.» изд. БЭБиМ. 1998. 200с.

Румянцев А.Г., Масчан А.А., «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей.» Изд. Медицинское информ. Агентство, Москва, 2003, 910 с.

Угрюмов М.В. Наука Долголетия 2001 №1 с.9-17.

Шумаков В.И. Блюмкин В.Н. СК (стволовые клетки)алецкий Н.Н. «Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы.» М. Канон. 1995. 382 с.

Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А и др. Российский кардиологический журнал 2003, №5, с 42-50.

Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., и др. Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, 3-6.

Шумаков В.И., Писаревский А.А., Онищенко Н.А., и др. в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения иск. органов». 1998, изд. Репроникс, Тула, с 338-367.

Шумаков В.И., СК (стволовые клетки)алецкий Н.Н. в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения иск. органов». 1998, изд Репроникс, Тула, с 93-118.

Дата добавления: 2014-01-15