Общая характеристика сигнальных молекул плотностно-зависимых систем у бактерий

В "эффектах кворума" установлено участие следующих классов соединений:

1) ацилированные лактоны гомосерина, регулирующие широкий круг плотностно-зависимых коллективных процессов у грамотрицательных бактерий;

2) пептиды, регулирующие конъюгативный плазмидный перенос у Enterococcus, развитие воздушного мицелия у Streptomyces, споруляцию у бацилл и др.;

3) аминокислоты и сходные с ними аминные соединения, регулирующие агрегацию бактериальных клеток (E. coli, Salmonella typhimurium, Myxococcus xanthus) и формирование швермеров у Proteus mirabilis.

1. Кворум-зависимые бактериальные системы, использующие ацилированные лактоны гомосерина как агентов межклеточной коммуникации (системы типа "luxI-luxR"). Классическим объектом служит морская светящаяся бактерия Vibrio fischeri. Свечение является плотностно-зависимым процессом, т. е. не наблюдается в разбавленных клеточных суспензиях, например, просто в толще морской воды (плотность культуры менее 102 клеток/мл. Свечение V. fischeri реализуется лишь в концентрированных культурах V. fischeri, в том числе в природных экологических нишах этой бактерии - в светящихся органах головоногого моллюска Euprymna scolopes, где плотность популяции достигает 10¹⁰-10¹¹ клеток/мл. Данная система, по-видимому, представляет пример взаимовыгодного межвидового сотрудничества: моллюск, ночное животное, извлекает выгоду из того, что светящиеся бактерии делают его незаметным для хищников снизу; свечение, напоминающее лунный свет, устраняет тень, которая иначе возникала бы, если бы лунные лучи освещали моллюска сверху. А бактерия извлекает выгоду из того, что моллюск предоставляет питание и укрытие. Биохимию и генетику свечения V. fischeri исследовали поэтапно. Вначале удалось показать, что свечение культур V. fischeri, находящихся на ранней экспоненциальной стадии развития, может быть индуцировано культуральной жидкостью, отделённой от клеток V. fischeri во время стационарной фазы. Впоследствие была детально охарактеризована генетическая система "luxI – luxR", оказавшаяся типичной для большинства известных плотностно-зависимых систем грамотрицательных бактерий.

Гены первого блока (luxICDABEG) имеют следующие функции: ген luxI кодирует белок (LuxI, 193 аминокислоты), который по всей вероятности функционирует как синтаза химического агента межклеточной коммуникации, чьё накопление в среде сигнализирует клеткам V. fischeri о достижении пороговой плотности (кворума) для биолюминесценции. Агент коммуникации синтезируется из S-аденозилметионина и 3-оксогексаноил-кофермента А и представляет собой N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина(3-ОГЛГ).

Гены luxA и luxB кодируют, соответственно, субъединицы a и b люциферазы (ферментного комплекса, ответственного за биолюминсценцию).

Гены lux C,D, E кодируют редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света)

Ген lux G кодирует редуктазу флавинмононуклетида (другой субстрат, также окисляемый в люциферазной реакции).

Второй генный блок - ген lux R, чей белковый продукт LuxR (250 аминокислот) связывает фактор 3-ОГЛГ. Комплекс LuxR-3-ОГЛГ связывается с промоторным участком оперона luxICDABEG и активирует его транскрипцию. В отсутствие достаточной концентрации 3-ОГЛГ в межклеточной среде, оперон luxICDABEG экспрессируется на низком "базовом" уровне. Белок LuxR в отсутствие 3-ОГЛГ функционирует как репрессор, в частности, гена luxR, кодирующего сам этот белок. По мере повышения концентрации клеток V. fischeriнакапливающийся в среде 3-ОГЛГ начинает выступать как "аутоиндуктор": наряду со структурными генами его комплекс с LuxR активирует и транскрипцию luxI, т.е. синтез самого 3-ОГЛГ, активирующего в комплексе с LuxR траскрипцию оперона lux в новых и новыхклетках V. fischeri. Поэтому лавинообразно нарастает синтез всех компонентов люциферазной системы и начинается интенсивное свечение бактерий.

По принципу описанной системы luxI-luxR организованы (с теми или иными модификациями) кворум-зависимые регуляторные системы и у ряда других грамотрицательных бактерий. В роли диффундируюших химических факторов коммуникации также выступают ацилированные лактоны гомосерина. Одна и та же бактерия может включать несколько плотностно-зависмых систем. Так, в последние годы показано, что рассмотренная выше светящаяся бактерия V. fischeri фактически имеет и вторую плотностно-зависимую систему регуляции биолюминисценции ainI-ainR со своим активатором транскрипции (AinR), связывающим диффузный фактор N-октаноил-L-лактон гомосерина.

Бактерии рода Erwinia (E. carotovora, E. chrysanthemii и др.) вызывают мягкую гниль картофеля, хризантем и других растений. Они расщепляют растительные клеточные стенки с помощью пектиназ и целлюлаз. Образование этих ферментов является важным фактором вирулентности Erwinia и представляет собой плотностно-зависимый процесс. Поэтому при достаточно высокой плотности популяции бактерий синтез ферментов происходит столь интенсивно, что клетки растений разрушаются раньше, чем их иммунная система успевает прореагировать на внедрение патогена. У Erwinia функционирует генная система expI-expR, аналог системы luxI-luxR у V. fischeri. Белок ExpI, частично гомологичный белку LuxI, необходим для синтеза диффузного фактора коммуникации – 3-ОГЛГ (как и у V. fischeri). В силу совпадения факторов коммуникации у Erwinia и у V. fischeri, введение плазмиды, содержащей все гены lux V. fischeri, за вычетом luxI, обусловливает плотностно-зависимую люминесценцию у E. carotovora.

У E. carotovora, кроме expI-expR, имеется также аналогичная генная система carI-carR. Система carI-carR ставит синтез антибиотика карбапенема, образуемого E. carotovora, в зависимость от плотности популяции. Активация синтеза антибиотика при высокой плотности популяции посредством системы carI-carR предположительно облегчает E. carotovora устранение бактерий-конкурентов, которые стремятся использовать продукты расщепления компонентов растительных клеток кворум-зависимыми экзоферментами E. carotovora.

Патогенная для человека и животных бактерия Pseudomonas aeruginosa ("синегнойная палочка"), подобно E. carotovora, синтезирует необходимые для вирулентности факторы – токсин А, экзоферменты (эластазы LasA и LasB, щелочную протеазу), гемолизины и поверхностно-активный рамнолипид при наличии бактериального кворума; имеются две генные системы: lasI-lasR и vsmI-vsmR.

Примеры с V. fisheri, E. carotovora и P. aeruginosa демонстрируют, что микробные клетке вступают во взаимодействие с макроорганизмом (растением или животным) только в том случае, если концентрация феромона (агента коммуникации) сигнализирует о достаточной плотности микробной популяции. Это взаимодействие может быть паразитического или/и взаимовыгодного (мутуалистического) типа. Данные о плотностно-зависимых системах типа luxI-luxR и соответствующих феромонах обобщены в таблице. Как уже было отмечено, многие из таких систем важны для регуляции поведения симбиотической (паразитической) микрофлоры, с целью налаживания взаимодействия с макроорганизмом.

Более того, коммуникация посредством ацилированных лактонов гомосерина может иметь межвидовой характер. В частности, вырабатываемый Pseudomonas aeruginosa феромон N-(3-оксо)-додеканоил-лактон гомосерина воспринимается эпителиальными клетками человека и индуцирует синтез интерлейкина-8, одного из факторов межклеточной коммуникации, участвующего в имунной защите у человека.

Некоторые системы с лактонами гомосерина в роли феромонов способствуют устранению микроорганизмов-конкурентов, синтезируя антибиотики, бактериоцины. Так, генная система phzI-phzR регулирует синтез противогрибковых антибиотиков у Pseudomonas aureofaciens. Актиномицеты рода Streptomyces располагают плотностно-зависимыми системами, регулирующими синтез антибиотиков, развитие воздушного мицелия и спорообразование. Феромонами в этой системе служат (γ-бутиролактоны гомосерина). Однако генетическая система отличается от luxI-luxR типа. γ-Бутиролактоны гомосерина (А-фактор у S. griseus) связываются не с активатором транскрипции, а с репрессором, теряющим активность в результате этого взаимодействия. В роли бактериоцина (ингибитора роста бактерий) выступает один из образуемых бактериями р. Rhizobium лактонов гомосерина, а именно N-(3R-окси-7-цис-тетрадеканоил)-L-лактон гомосерина.

Соединения, напоминающие сигнальные агенты плотностно-зависимых систем прокариот, могут вырабатываться эукариотическими клетками как конкурентами или антагонистами прокариотов. "Зная" об информационных функциях подобных химических веществ у прокариот, эукариоты, вероятно, создают своего рода "дезинформационные помехи", "сбивая с толку" бактериальные клетки. Возможно, именно поэтому, например, галогенированные фураноны – близкие аналоги ацилированных лактонов гомосерина – образуемые красной водорослью р. Delysea, представляют собой эффективные антимикробные агенты [85].

Необходимо отметить, что феромоны микроорганизмов и, в частности, ацилированные лактоны гомосерина, могут использоваться в межвидовых взаимодействиях не только в роли антибиотиков/бактериоцинов, но также и в специяической роли сигнальных агентов. Это возможно потому, что различные виды микроорганизмов нередко имеют идентичные или очень сходные по химической природе феромоны. В этой связи интересно, что, например, выделяемые P. аeruginosa внеклеточные вещества усиливают вирулентность факультативной патогенной бактерии Burkholderia cepacium.

2. Кворум-зависимые системы с пептидными и белковыми феромонами. "Классической" пептидной кворум-зависимой системой можно считать систему, отвечающую за конъюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis и родственных бактериальных видов. Подобно рассмотренным системам типа luxI-luxR, эта система стимулирует распространение в микробной популяции признаков, важных для взаимодействия микроорганизма и животного-хозяина, а также для устранения микробных конкурентов. Так, переносимая пептидной кворум-зависмой системой плазмида pAD1 отвечает за синтез гемолизинов, плазмида pCD1 – за образование бактериоцина, а плазмида pCF10 – за устойчивость E. faecalis к тетрациклину.

Каждый феромон (гекса- или октопептид) индуцирует слипание (clumping) бактериальных клеток и их конъюгацию с переносом от донора к реципиенту определённой плазмиды. Например, октапептид cPD1 стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPD1. Плазмида кодирует феромонный рецептор, находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Так, плазмидa pPD1 несёт ген traA с указанной функцией. Феромон взаимодействует с рецептором и выводит из строя репрессор, запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPD1 включает также ген traC, чей продукт представляет собой феромон-связывающий белок, облегчающий проникновение пептида-феромона через клеточную стенку (эффективность феромона в сферопластах не зависит от экспрессии гена traC). Феромоны интенсивно синтезируют только клетки, не несущие соответствующих плазмид. У клеток-доноров подавлен синтез феромона; более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид. Продуктом плазмиды pPD1, например, является пептид iPD1, инактивирующий феромон cPD1.

У Bacillus subtilis споруляция эффективно происходит при высокой плотности клеточной популяции или при добавлении культуральной жидкости от подобной популяции. Процесс регулируется плотностно-зависимой системой с олигопептидным сигнальным агентом, кодируемым геном pfrA в форме неактивного предшественника (пептида, состоящего из 41 аминокислоты). При экскреции из клетки у этого пептида, как у многих других сигнальных пептидов, отщепляется N-концевая последовательность. Остающийся пептид (19 аминокислот) в свою очередь подвергается воздействию внеклеточной пептидазы, в результате чего получается активный сигнальный пентапептид (РЕР5).

Выяснен механизм активации споруляции у B. subtilis посредством РЕР5. Он поглощается внутрь клетки с помощью пермеазы олигопептидов и при достаточной концентрации ингибирует фосфатазу RapA, образуя с ней неактивный комплекс. В отсутствии активной фосфатазы ключевые факторы споруляции Spo0F и Spo0A поддерживаются в рабочем – фосфорилированном – состоянии. Интересно, что ген фосфатазы rapA ко-транскрибируется вместе с геном pfrA – они образуют единый оперон. При низкой клеточной плотности образуемый после экскреции и процессинга PfrA пептид РЕР5 поступает в клетку в низкой (подпороговой) концентрации, и тогда Spo0F и Spo0A дефосфорилируются посредством RapA – споруляции не происходит. Достижение кворума означает формирование комплекса PfrA:PEP5 и, соответственно, запуск программы споруляции.

Интересно, что как и системы типа luxI-luxR, пептидные плотностно-зависимые системы регуляции во многих случаях функционируют у симбиотических/паразитических микроорганизмов. Более того, макроорганизм также использует пептидные сигнальные агенты, выступающие в роли внутриорганизменных регуляторов. Например, в ответ на внедрение бактерий рода Rhizobium растение-хозяин (горох, соя и др.) образует пептид (около 10 аминокислот), который модифицирует эффект гормона ауксина на растительные клетки. А именно, изменяется концентрационная зависимость стимуляции ауксином клеточных делений. В норме (без этого пептида) максимальная стимуляция наблюдается при ~5 мкМ ауксина, и эффект ослабляется при повышении концентрации ауксина. Однако в присутствии пептидного регулятора кривая концентрационной зависимости имеет плато вплоть до ~20 мкМ. Белковый феромон в плотностно-зависимой системе у одноклеточной эукариоты – водоросли Volvox carteri – стимулирует рост этого микроорганизма уже в концентрации около 10^{-16 М.}

3. Кворум-зависимые системы с феромонами аминной (аминокислотной) природы.

Рассмотренные выше плотностно-зависимые системы типа luxI-luxR фактически относятся к системам, базирующимся на производных аминокислоты, а именно гомосерина. Гомосерин не входит в состав белков, но служит универсальным для всех живых организмов интермедиатом в синтезе некоторых аминокислот. Мы рассмотрели ацилированные лактоны гомосерина отдельно только потому, что эта система коммуникации является классической.

Макро- и микроструктура колоний E. coli формируется под влиянием образуемых ее клетками градиентов атрактанта - аспарагиновой кислоты. Сложные орнаменты (концентрические круги, гексагональные решетки и др.) формируются при наложении двух градиентов феромона - 1)исходящего от центра колонии и 2) образуемого клетками на её периферии. Аспарагиновая кислота в то же время представляет собой эволюционно-консервативный сигнальный агент, втом числе один из нейротрансмиттеров (веществ, передающих возбуждение от нейрона к нейрону) у млекопитающих.

В этой связи интересно, что другие нейротрансмиттеры, а именно биогенные амины, также эволюционно-консервативные сигнальные молекулы, содержатся у микроорганизмов и, будучи добавленными к их культурам, оказывают ростовые и структурные эффекты на микробные колонии. Так, серотонин (5-гидрокситриптамин), нейротрансмиттер и гистогормон у высших организмов, в то же время представляет интерес как возможный агент микробный коммуникации. Это предположение базируется на данных о стимуляции агрегации клеток E. coli, Rhodospirillum rubrum и миксобактерий рода Polyspondilum добавленным серотонином. В тех же концентрациях (10^-7 - 10^{-5 М) серотонин стимулирует рост микроорганизмов.}

Другой нейротрансмиттер и гормон - норадреналин, также ускоряет рост патогенных энтеробактерий. У патогенных штаммов он стимулирует синтез адгезина К99 и Шига-подобных токсинов I и II. Примечательно, что норадреналин не стимулирует рост непатогенных штаммов E. coli. Всё это подкрепляет предположение об адаптивном характере ноадреналин-зависимой стимуляции роста бактерий. Патогенные энтеробактерии используют защитную реакцию организма (интенсивный синтез норадреналина в ответ на стресс, вызванный инфекцией) ради собственного блага. Микроорганизмы содержат многие другие нейротрансмиттеры и гормоны (гистогормоны) высших животных (γ-аминомасляная кислота, β-аланин, инсулин и др.), которые участвуют как во взаимодействиях между симбиотической/паразитической микробиотой и макроорганизмом, так, по-видимому, и в межклеточной коммуникации у микроорганизмов.

Исследование роли эволюционно-консервативных аминов и аминокислот в межклеточной коммуникации микроорганизмов и во взаимодействии микробиоты и животного организма – современное научное направление.

Представляет интерес также наличие у микроорганизмов белков, гомологичных рецепторам нейромедиаторов. Так, пурпурная фототрофная бактерия Rhodobacter sphaeroides содержит гомолог бензадипинового рецептора — одного из типов рецепторов к тормозному нейромедиатору γ-аминомасляной кислоте. Известно, что митохондрии эукариотических клеток – симбиотические потомки прокариот, а именно, той их подгруппы, в состав которой входит и R. sphaeroides. Поэтому исследования бактериальных рецепторов к нейромедиаторам и в целом эффектов эволюционно-консервативных нейромедиаторов в микробных системах весьма актуальны для нейрохимии мозга в связи с данными о роли митохондрий мозговых нейронов в связывании нейромедиаторов. Mитохондрии нейронов содержат рецепторы к глутамату (NMDA-подтипа). Если глутамат присутствует в высоких концентрациях, его связывание с этими митохондриальными рецепторами ведёт к массивному поступлению ионов Са 2+ внутрь митохондрий, диссипации мембранного потенциала, снижению внутриклеточной концентрации АТФ и в конечном счёте к апоптозу. Апоптоз нейронов мозга в связи с избыточными концентрациями глутамата и других нейромедиаторов, вероятно, происходит при таких нейродегенеративных заболеваниях, как ишемический инсульт, болезни Паркинсона, Альцгкймера и Хантингтона.

Необходимо указать на ещё один класс микробных сигнальных молекул, также представляющих собой эволюционно-консервативные агенты – на олигосахарины. К данному классу веществ относятся короткие цепочки из моносахаридных остатков, к которым могут быть прикреплены липидные фрагменты. Пример представляет факторы Nod, вырабатываемые клубеньковыми бактериями (р. Rhizobium, плотностно-зависимая система типа luxI-luxR рассмотрена выше) в контексте обмена сигналами между ними и клетками бобового растения-хозяина. Выделяемые растением флавоноиды активируют транскрипцию бактериальных генов nod. Непосредственно активируется ген nodD, чей продукт служит активатором других генов nod. Продукты этих генов (в частности NodС) отвечают за синтез факторов Nod – ацилированных коротких хитиновых фрагментов (2-5 хитиновых мономеров в цепи). Они вызывают множественные эффекты на корневые клетки, приводящие к их дедифференцировке, активному делению и формированию клубеньков, содержащих клетки бактерий, превратившиеся в азотфиксирующие бактероиды под воздействием сигналов растения.

В свете современных данных, олигосахарины и подобные им соединения образуются также высшими растениями и животными. Так, белок DG42, гомолог NodC Rhizobium, присутствует в эмбрионах лягушки Xenopus начиная со стадии средней бластулы и вплоть до стадии нейрулы. Белок DG42 также способен к синтезу хитиновых олигосахаридов.

E. coli, Bacillus subtilis, дрожжи Candida utilis выделяют в окружающую среду ряд однотипных соединений, способствующих адаптации микроорганизмов к разным стрессовым условиям - смене среды роста, повышенной температуре, присутствию антибиотиков или N-этилмалеимида:

4) "m -замедлина" (фактора ХII), снижающего скорость роста бактерий и тем самым способствующего преодолению стресса по принципу "снижая передачу у автомобиля, повышаешь его проходимость";

5) антилизина (фактора ХI), ускоряющего адаптацию клеток к N-этилмалеимиду (не обнаружен у C. utilis);

6) "фактора ускоренной адаптации к новой среде" (ФУАНС).

Подобно лактонам гомосерина, данные сигнальные вещества активны и на межвидовом уровне – так, феромоны E. coli вызывают специфические эффекты у B. subtilis и C. utilis (например, "m -замедлин" E. coli оказывал рост-ингибирующее действие на растущие клетки B. subtilis).

Рассмотренный ряд важнейших химических факторов коммуникации между микробными клетками, конечно, остаётся неполным. Список микробных сигнальных агентов непрерывно пополняется в последние годы, особенно в связи с изучением эволюционно-консервативных агентов межклеточной/межорганизменной коммуникации. Помимо рассмотренных биогенных аминов, к ним относятся также, например, активные формы кислорода (АФК), такие как О^2-, Н₂О₂, ОН• и их производные. АФК, вероятно, выступают как водители ритма колебательных процессов, регулирующих активность различных биосистем; их воздействие может передаваться в виде резонансного возбуждения по межклеточному матриксу; матрикс способен к генерации собственных АФК, хотя и с низкой эффективностью. Как производное АФК рассматривают окись азота, нейромедиатор и эволюционно-консервативный регулятор разнообразных процессов у про- и эукариот.

ТАБЛИЦА. Примеры феромонов плотностно-зависимых систем микроорганизмов

Микроорганизм	Функция	Феромон
1. Системы типа " luxI-luxR " и др. системы с производными лактонов гомосерина
Vibrio fischeri	Биолюминесценция	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
	Биолюминесценция	N-октаноил-L-лактон гомосерина
V. harveyi	Биолюминесценция	N-(3-оксибутаноил)-L-лактоном гомосерина
	Биолюминесценция	Не идентифицированное соединение AI-2
Erwinia carotovora	Синтез внеклеточных гидролитических ферментов (пектиназ, целлюлаз и др.)	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
	Синтез антибиотика карбапенема	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
Pseudomonas aeruginosa	Синтез факторов вирулентности (система lasI-lasR)	N-(3-оксододеканоил)-L-лактон гомосерина
	Синтез факторов вирулентности (система vsmI-vsmR, или rhlI-rhlR)	N-бутаноил-L-лактон гомосерина
Agrobacterium tumefaciens	Конъюгативный перенос Ti-плазмид	N-3-(оксо-октаноил)-L-лактон гомосерина
Serratia liquefaciens	Стимуляция движения клеток-швермеров по агару	N-бутаноил-L-лактон гомосерина
Yersinia enterocolitica	Инфекционный процесс с участием Yop-белков	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина и N-гексаноил-L-лактон гомосерина
Streptomyces griseus	Синтез стрептомицина, развитие воздушного мицелия, споруляция. Примечание: системы стрептомицетов отличаются от типичной системы "luxI-luxR" (см. текст)	2-изокапроил-3-оксиметил-γ-бутиролактон гомосерина
S. virginiae	Синтез виргиниамицина	Различные бутиролактоны и бутанолиды
2. Системы с пептидными (белковыми) феромонами
Enterococcus faecalis	Конъюгативный перенос плазмид	Гекса- или октопептиды, например cPD1 (H-Phe-Leu-Val-Met-Phe-Leu-Ser-Gly-OH)
Bacillus subtilis	Споруляция. Компетентность к трансформации	Пентапептид H-Ala-Arg-Asn-Glu-Thr-OH и др.
Streptococcus pneumoniae	Компетентность к трансформации	Гептадекапептид H-Glu-Met-Arg-Leu-Ser-Lys-Phe-Phe-Arg-Asp-Phe-Ile-Leu-Gln-Arg-Lys-Lys-OH
Xanthomonas maltophila	Стимуляция роста	Гомолог хорионного гонадотропина
Micrococcus luteus	Стимуляция роста после периода покоя	Белок (мол. вес 19 кДа)
Volvox carteri (зелёная водоросль)	Половой процесс	Гликопротеин
Paramecium tetraurelia (инфузория)	Стимуляция роста	Белок (мол. вес 17 кДа)
3. Системы с аминными/аминокислотными феромонами
Myxococcus xanthus	Роение и образование плодовых тел (ранние этапы)	Фактор А – смесь аминокислот (с преобладанием тирозина, пролина, фенилаланина, лейцина, изолейцина) с примесью коротких пептидов
Proteus mirabilis	Формирование швермеров	Глутамин
E. coli	Колониальная макро- и микроструктура	Аспарагиновая кислота

См. также:
А.В.Олескин Биополитика
A.V.Oleskin, R.D.Masters Biopolitics in Russia: History and Prospects for the Future
А.В.Олескин, И.В.Ботвинко, Т.А.Кировская Микробная эндокринология и биополитика
А.В.Олескин, И.В.Ботвинко, Е.А.Цавкелова Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов
А.В.Олескин Сетевая организация социума и биополитика
А.В.Олескин Сетевые структуры в современной России и биополитика