Нарушения клеточной подвижности

В немышечной клетке около половины всех молекул миозина находятся в свернутом состоянии и не способны образовывать филаменты. Фосфорилирование (Ф) легких цепей миозина КЛЦМ активирует миозин и нарушает внутримолекулярные связи, приводя к распрямлению молекул миозина и их спонтанной полимеризации в активные филаменты, готовые к генерации силы. При дифференцировке гладкомышечных клеток формируются длинные филаменты с боковой полярностью, при которой моторные головки плотно упакованы сбоку филамента и взаимодействуют с соседними филаментами актина, создавая продольные тянущие усилия. При развитии клеток скелетных мышц и сердца происходит замена немышечных изоформ миозина на саркомерный миозин II, который формирует ограниченные по длине гантелеобразные филаменты с моторными частями на концах филамента и средней частью, содержащей только хвосты. В созревающих кардиомиоцитах (показано на врезке) и гладкомышечных клетках функционирует дополнительный путь формирования филаментов из несаркомерного миозина. Генетически родственный КЛЦМ белок KRP распрямляет молекулу миозина, но не включает ее моторную активность. В результате собираются неактивные миозиновые филаменты, которые, вероятно, играют важную роль в поддержании структуры сократительных волокон в гладких мышцах и предшественников миофибрилл в сердце. Активность этих филаментов также регулируется КЛЦМ и фосфатазой легких цепей миозина.

Белки-регуляторы

Молекулярно-генетические исследования локуса КЛЦМ в геноме высших позвоночных, начатые более 10 лет назад, оказались фундаментально важными, поскольку позволили выявить значительно более сложную систему регуляции клеточной подвижности с участием КЛЦМ, нежели просто фосфорилирование миозина. Выяснилось, что хромосомный локус КЛЦМ имеет сложное строение, выпадающее из общепринятого тогда принципа "один ген - один белок". Этот локус кодирует три семейства белковых продуктов: высокомолекулярную (характерную для клеток эндотелия и эпителия) и низкомолекулярную (основную во всех остальных клетках) изоформы КЛМЦ, а также белок KRP (от англ. Kinase-Related Protein, что отражает его родство с КЛЦМ) [2, 3]. Именно ген KRP и представляет собой пример "гена в гене" - он расположен внутри гена КЛЦМ, использует ту же рамку считывания, но при этом полностью независим [4]. Такое устройство генома ранее наблюдали у вирусов, считая его примером эволюционной "компрессии" генетической информации. Однако полная расшифровка генома человека показала, что такая структура может быть типичной и для высокоорганизованных организмов. Были обнаружены и другие примеры так называемых генов-матрешек, в которых кодирующие нуклеотидные последовательности вставлены одна в другую, поэтому каждый меньший по размеру белок существует и отдельно, и как часть большего белка. Соответственно, высокомолекулярный белок наследует все свойства низкомолекулярного компонента и дополнительно проявляет свои собственные. Так, KRP взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозинами и собирает их в филаменты. В то же время, миозиновый мотор запускает КЛЦМ, а не KRP, поскольку в его составе нет необходимых аминокислотных последовательностей, определяющие протеинкиназную активность. Более того, в клетках, где есть оба этих регулятора, KRP становится антагонистом КЛЦМ, нарушая ее взаимодействие с миозином.

Таким образом, хотя принцип сокращения скелетных, сердечных и гладких мышц и немышечных клеток одинаков, основные пути регуляции сокращения в этих системах различаются. Тем не менее саркомерный миозин также может фосфорилироваться и изменять силовые характеристики, а в гладкой мышце функционирует система инактивации сокращения, связанная с филаментами актина и основанная на участии гладкомышечного аналога тропонина - белка кальдесмона. В мускулатуре сосудов координированная деятельность обеих систем играет важную роль в регуляции тонуса, что было установлено в результате многочисленных исследований, проведенных в том числе и в нашей лаборатории. Тонус сосудов напрямую зависит от активности КЛЦМ и кальдесмона в гладкомышечных клетках. При гиперактивации КЛЦМ и подавлении функций кальдесмона развивается спазм и ишемическое поражение тканей, например, инфаркт миокарда в случае коронарных артерий или инсульт при спазме сосудов головного мозга. Снижение активности КЛЦМ, напротив, приводит к расслаблению сократительной системы гладких мышц сосудов, снижению артериального давления и восстановлению кровоснабжения сердца. На этом основано действие некоторых кардиологических препаратов (антагонистов кальция, нитратов, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, папаверина и бета-блокаторов).

Важное свойство гладкомышечных клеток сосудов - их способность перестраивать сократительный аппарат и метаболизм и превращаться в фибробластоподобные клетки. Это происходит, в частности, в результате нарушения целостности эндотелиальной выстилки сосудистой стенки и прямого контакта содержащихся в крови факторов роста с гладкомышечными клетками интимальной (внутренней) оболочки сосудов. Такие клетки начинают активно мигрировать в направлении пораженного участка, размножаться и секретировать белки внеклеточного матрикса, заполняя просвет сосуда. Эти события происходят при атеросклерозе, часто после ангиопластики и аортокоронарного шунтирования, вызывая повторное сужение сосудистого русла, или рестеноз. Миграция, деление и секреторная активность гладкомышечных клеток также опосредуются изменениями активностей миозина II, КЛЦМ и кальдесмона. Очевидно, что если научиться селективно подавлять эти процессы, можно предотвратить формирование рестенозов. И такие попытки уже делаются, наиболее перспективны из них - применение синтетических ингибиторов КЛЦМ, а также воздействие на кальдесмон-зависимую систему регуляции.

Недавно была установлена важная роль эндотелиальной высокомолекулярной изоформы КЛЦМ в регуляции сосудистой проницаемости, необходимой для обмена биологически активными молекулами, питательными веществами, газами и клетками иммунной системы между кровью и тканями организма [10]. У мышей с избирательным генетическим нокаутом этой изоформы КЛЦМ существенно снижена проницаемость микрососудов, в том числе и для токсических веществ, которые проходят из кровотока в ткань и вызывают ее поражение. Сокращение эндотелия опосредуется немышечным миозином и регулируется главным образом КЛЦМ. Ее отсутствие в клетках эндотелия приводит к уменьшению проницаемости монослоя, по-видимому, за счет потери способности клеток к сокращению и образованию щелей между ними, в которые могут проходить белковые молекулы и даже клетки. Примечательно, что тех же эффектов можно добиться, вводя в кровь нормальным мышам ингибитор КЛЦМ, одной из первых мишеней которого будет эндотелий сосудов. Сегодня ученые думают о том, как использовать антагонисты КЛЦМ в кардиологии. Одним из возможных применений может стать ограничение поражения миокарда при операциях на сердце. Временная остановка кровообращения в сердце приводит к ишемии и повышению проницаемости капилляров, а восстановление кровотока - к разносу токсических продуктов метаболизма из зоны ишемии в здоровые участки миокарда. Включение ингибитора КЛЦМ в кардиопротективные растворы может, таким образом, снизить масштабы повреждения сердца при операциях. Другими областями применения ингибиторов КЛЦМ могут быть отек легких, кардиогенный и травматический шок, сепсис и другие патологии, при которых остро нарушается сосудистая проницаемость.

Исследования последних лет, проведенные в нашей лаборатории, показывают, что присутствие КЛЦМ и KRP критично на самых ранних этапах развития кардиомиоцитов и необходимо для формирования правильной саркомерной структуры. Если избирательно подавить синтез этих белков с помощью так называемых антисмысловых олигонуклеотидов (коротких фрагментов ДНК, взаимодействующих с информационной РНК, кодирующей данный белок), то в эмбриональных кардиомиоцитах практически останавливается образование саркомеров и клетки теряют способность сокращаться. Поскольку ни КЛЦМ, ни KRP не взаимодействуют с саркомерным миозином, то наиболее вероятной молекулярной мишенью для них становится немышечный миозин, также присутствующий в кардиомиоцитах. Он входит в состав предшественников миофибрилл (премиофибрилл) и должен находиться в филаментарном состоянии для того, чтобы премиофибриллы слились друг с другом и образовали полноценные сократительные волокна, состоящие из саркомеров. По всей видимости, роль КЛЦМ и KRP состоит в поддержании филаментарного состояния немышечного миозина премиофибрилл, без которого их дальнейшее развитие невозможно. Таким образом, белковые продукты генетического локуса КЛЦМ - важные участники формирования сердца у эмбриона.

Процесс образования новых миофибрилл происходит и во взрослом сердце. Как известно, клетки сердца не делятся, но способны отвечать на возрастающую гемодинамическую нагрузку путем увеличения массы и мощности сократительного аппарата. Такая гипертрофия сердца может происходить как в норме (например, у спортсменов, испытывающих большие физические нагрузки), так и при заболеваниях сердца различной этиологии. В наиболее тяжелых формах разрастание ткани сердца приводит к сокращению размеров его камер, снижению объема выбрасываемой крови и представляет угрозу для жизни пациента. Единственный радикальный в наши дни метод лечения таких состояний - оперативное удаление части миокарда, которое продлевает жизнь больного, но не устраняет причину заболевания. Исследование молекулярных механизмов гипертрофии миокарда может дать ту необходимую информацию, которая позволит установить диагноз на ранней стадии, провести фармакологическое лечение и избежать операции. Ранними маркерами гипертрофии и соответственно потенциальными мишенями для воздействия лекарств могут быть именно КЛЦМ и KRP. В экспериментах на животных установлено, что гипертрофия миокарда сопровождается увеличением синтеза этих белков [11, 12]. Эти данные были подтверждены и при обследовании людей, страдающих той же патологией [13]. Вероятно, при гипертрофии сердечная клетка запускает тот же молекулярный механизм, что и в эмбриональный период, когда происходил синтез миофибрилл, регулируемый КЛЦМ и KRP. Подавив в культивируемых кардиомиоцитах биосинтез этих регуляторных компонентов, удалось остановить сборку миофибрилл. Остается лишь разработать антигипертрофические лекарственные препараты, и бороться с этим тяжелейшим недугом человека станет намного проще.

Значительно сложнее лечить наследственные формы гипертрофии миокарда, связанные с мутациями генов, кодирующих синтез миозина, тропонина, титина и других белков саркомера. Естественно, организм сам пытается справиться с возникшими нарушениями, но вновь синтезированные миозиновые моторы или аномальные саркомеры также несут врожденные дефекты, и это только усугубляет положение. Сейчас такие заболевания уже можно выявить с помощью генетических методов, а в перспективе, с дальнейшим развитием методов генной и клеточной терапии, их можно будет лечить, заменяя дефектные гены или несущие их клетки на нормальные. Ясно, что для успешной репарации компонентов сердечно-сосудистой системы совершенно необходимы фундаментальные исследования в области клеточной подвижности, ведь список белковых компонентов двигательной системы клетки не ограничивается миозином, КЛЦМ и KRP, рассмотренных в этой короткой статье. Более того, регулярно появляются сообщения об открытии новых белков, участвующих в клеточной подвижности, что отражает сложность и многогранность процесса. Его изучение сегодня требует мультидисциплинарного подхода, и есть все основания ожидать, что многие полученные на этом пути знания рано или поздно найдут применение в практической кардиологии и других областях медицины.

Активный транспорт. Транспорт веществ из среды с низкой концентрацией в

среду с более высокой концентрацией не может быть объяснен движением по

градиенту, т.е. диффузией. Этот процесс осуществляется за счет энергии

гидролиза АТФ или энергии, обусловленной градиентом концентрации

каких-либо ионов, чаще всего натрия. В случае, если источником энергии

для активного транспорта веществ является гидролиз АТФ, а не перемещение

через мембрану каких-то других молекул или ионов, транспорт называется

первично активным.

Первично-активный перенос осуществляется транспортными АТФа-зами,

которые получили название ионных насосов. В клетках животных наиболее

распространена Na+,K+ — АТФаза (натриевый насос), представляющая собой

интегральный белок плазматической мембраны и Са2+ — АТФазы, содержащиеся

в плазматической мембране сарко-(эндо)-плазматического ретикулума. Все

три белка обладают общим свойством — способностью фосфорилироваться и

образовывать промежуточную фосфорилированную форму фермента. В

фосфорилиро-ванном состоянии фермент может находиться в двух

конформациях, которые принято обозначать Е1 и Е2. Конформация фермента —

это способ пространственной ориентации (укладки) полипептидной цепи его

молекулы. Две указанные конформации фермента характеризуются различным

сродством к переносимым ионам, т.е. различной способностью связывать

транспортируемые ионы.

Na+/K+- АТФаза обеспечивает сопряженный активный транспорт Na+ из клетки

и К+ в цитоплазму. В молекуле Na+/K+- АТФазы имеется особая область

(участок), в которой происходит связывание ионов Na и К. При

конформации фермента E1 эта область обращена внутрь

клетки и обладает большим сродством к Na+, а при конформации Е2 —

наружу и имеет высокое сродство к К+. В присутствии АТФ и Na+ в

цитоплазме запускается фосфорилирование фермента и происходит

присоединение 3-х ионов натрия к области связывания ионов в молекуле

Na+/K+-АТФазы. В результате происходит такое изменение конформации

фермента, при котором участок молекулы, присоединивший 3 иона натрия,

оказывается на наружной стороне мембраны и его сродство к ионам натрия

уменьшается (переход в форму Е2). Уменьшение сродства Na, К-АТФазы к Na+

приводит к освобождению этих ионов во внеклеточную жидкость.

В новой конформации фермента (Е2) его область связывания обладает

высоким сродством к К+. Связывание 2-х ионов калия ведет к

дефосфорилированию фермента и второму изменению конформации молекулы —

переход в Е,. В конформации E1 область связывания ионов в молекуле Na+,

К+ — АТФазы вновь обращена внутрь и имеет высокое сродство к Na+ и

низкое к К+. Ионы калия освобождаются в цитоплазму и цикл работы

фермента повторяется.

Таким образом, соотношение числа переносимых за один цикл работы

фермента ионов натрия и калия и, соответственно, электрических зарядов

равно 3/2. Следовательно, этот ионный насос является электрогенным — при

его работе возникает чистый поток положительных зарядов из клетки —

выходящий ток.

Активный транспорт Са2+ осуществляется Са2+-АТФазой, для которой также

характерно циклическое изменение сродства к переносимому иону. Например,

в скелетной мышце имеется сложная сеть трубочек и пузырьков —

саркоплазматический ретикулум. Его основная функция — регуляция

концентрации Са2+ в цитоплазме. Низкая концентрация Са2+ в цитоплазме в

покоящейся мышце поддерживается благодаря работе Са2+-АТФазы мембраны

саркоплазма-тического ретикулума. Цикл превращения этого фермента в

процессе транспорта Са2+ из цитоплазмы, где его концентрация низкая

(менее 10-7 М), в трубочки и пузырьки саркоплазматического ретикулума,

где его концентрация высокая (10-3 — 10-2 М) состоит в следующем.

Когда в цитоплазме скелетного мышечного волокна присутствует АТФ и Са2+

происходит фосфорилирование Са2+-АТФазы и присоединение Са2+ к особой

области фермента, которая называется кальций-связывающим участком. Этот

участок молекулы Са2+-АТФазы в конформации Е, обращен в цитоплазму

мышечного волокна. Фосфорилирование фермента и связывание Са2+ ведет к

изменению конформации молекулы, в результате которого

кальций-связывающий участок оказывается уже на стороне мембраны,

обращенной в просвет саркоплазматического ретикулума. В новой

конформации (Е2) фермент обладает меньшим сродством к Са2+, поэтому Са2+

отщепляется от него и поступает во внутриретикулярное пространство.

Следующая стадия превращения фермента — дефосфорилирование и второе

изменение конформации молекулы, при котором его сродство к Са2+ вновь

увеличивается и кальций-связывающий участок оказывается на обращенной в

цитоплазму стороне мембраны саркоплазматического ретикулума. Для осуществления этой стадии превращения

Са2+-АТФазы необходимо присутствие в саркоплазмати-ческом ретикулуме

ионов магния. В последующем цикл работы фермента повторяется.

Вторичный активный транспорт. Вторичным активным транспортом называется

перенос через мембрану вещества против градиента его концентрации за

счет энергии градиента концентрации другого вещества, создаваемого в

процессе активного транспорта. В клетках животных основным источником

энергии для вторичного активного транспорта служит энергия градиента

концентрации ионов натрия, который создается за счет работы Na+/K+ -

АТФазы. Например, мембрана клеток слизистой оболочки тонкого кишечника

содержит белок, осуществляющий перенос (симпорт) глюкозы и Na+ в

эпителиоциты. Транспорт глюкозы осуществляется лишь в том случае, если

Na+, одновременно с глюкозой связываясь с указанным белком, переносится

по электрохимическому градиенту. Электрохимический градиент для Na+

поддерживается активным транспортом этих катионов из клетки.

В головном мозге работа Na+-насоса сопряжена с обратным поглощением

(реабсорбцией) медиаторов — физиологически активных веществ, которые

выделяются из нервных окончаний при действии возбуждающих факторов.

В кардиомиоцитах и гладкомышечных клетках с функционированием Na+,

K+-АТФазы связан транспорт Са2+ через плазматическую мембрану, благодаря

присутствию в мембране клеток белка, осуществляющего противотранспорт

(антипорт) Na+ и Са2+. Ионы кальция переносятся чере мембрану клеток в

обмен на ионы натрия и за счет энергии концентрационного градиента

ионов натрия.

В клетках обнаружен белок, обменивающий внеклеточные ионы натрия на

внутриклеточные протоны — Na+/H+ — обменник. Этот переносчик играет

важную роль в поддержании постоянства внутриклеточного рН. Скорость, с

которой осуществляется Na+/Ca2+ и Na+/H+ — обмен, пропорциональна

электрохимическому градиенту Na+ через мембрану. При уменьшении

внеклеточной концентрации Na+ ингибировании Na+, K+-АТФазы сердечными

гликозидами или в бескалиевой среде внутриклеточная концентрация кальция

и протонов увеличена. Это увеличение внутриклеточной концентрации Са2+

при ингибировании Na+, K+-АТФазы лежит в основе применения в клинической

практике сердечных гликозидов для усиления сердечных сокращений.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о существовании в мембранах эукариот специализированных микродоменов, обогащенных холестерином и сфинголипидами, которые были названы "rafts" (плот, паром) (Brown, London, 1998а; Rietveld, Simons, 1998). "Rafts" представляют собой упорядоченные жидкие домены в мембране (liquid ordered phase domains) (Brown. London, 1998b). Показана важная роль этих липидных микродоменов в процессах передачи сигналов в клетках. Так, обнаружено, что в микродоменах, обогащенных холестерином и сфинголипидами, концентрируются многие белки, участвующие в процессах внутриклеточной сигнализации: NO-синтаза, Ras белки, тирозинкиназы семейства Src (Melkonian et al., 1999), гетеротримерные G-белки (Moffett et al., 2000), потенциал-зависимые K+-каналы Kv2.1 (Martens et al., 2000). Миристоилирование и пальмитоилирование белков является необходимым и достаточным для взаимодействия их с липидными микродоменами (Melkonian et al., 1999; Moffett et al., 2000). Показано, что "rafts" играют важную роль в обеспечении структурно-функциональной организации кавеол (Brown, London, 1998a,b). Однако в последнее время обнаружено участие этих липидных микродоменов в процессах передачи сигналов и в тех клетках, в которых кавеолы отсутствуют (Т-лимфоциты, базофилы) (Janes et al., 1999).

Для каждого фактора, действующего на клетку, можно, как правило, выделить основную сигнальную систему, преимущественно определяющую характер формируемого ответа. Однако в большинстве случаев, процесс активации находится под контролем не одной, а нескольких систем внутриклеточной сигнализации, так что важным фактором формирования ответа клеток становится взаимосвязь этих систем.

Разнообразные взаимодействия сигнальных систем обеспечивают уникальность пути формирования каждого процесса, несмотря на использование для передачи информации внутри клетки небольшого числа универсальных посредников. Несомненно, что исследование механизмов, обеспечивающих совместный контроль передачи информации в клетке различными системами посредников, будет основным направлением работ в этой области в ближайшие годы.

5. Механизмы Са2+-сигнализации в клетках 5.1. Са2+ - универсальный вторичный мессенджер

Исследование механизмов формирования клеточного ответа на стимул - одна из наиболее активно развивающихся областей клеточной биологии. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Са* ( Berridge, Irvine, 1989; Berridge, 1990; см. обз. Крутецкая, Лебедев, 1992а; Berridge, 1993; Clapham, 1995а, 1995b; Bootman et al., 1997; см. обз. Крутецкая, Лебедев, 2001). Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации ионов Са21 играют ключевую роль в запуске и регуляции общих и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокращение, передача нервного импульса, иммунный ответ и т.д. (Berridge, 1995b, 1997а, 1997b; Berridge et al., 1998).

Впервые важная роль Са2+ как внутриклеточного регулятора была установлена английским физиологом Сиднеем Рингером в 1883 г. (Ringer, 1883) в классических опытах, показавших, что механическая активность сердца тормозится, если во внешней среде нет Са"*. Спустя 100 лет Тьен с соавторами (Tsien et al, 1984) сообщили о возможности измерения внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Ca2+]i) в клетках млекопитающих с помощью Са2+-флуоресцентного зонда Quin 2. К настоящему времени существует уже несколько поколений высоко чувствительных флуоресцентных Са"+-зондов, позволяющих измерять концентрацию Са2+ в цитозоле и во внутриклеточных органеллах (Grynkiewicz et al, 1985; Kao, 1994; Takahashi et al, 1999; Baylor, Hollingworth, 2000).

Ca~* является универсальным вторичным мессенджером, действующим в клетках бактерий, растений и животных. Са2* необходим для жизнедеятельности клеток, и в то же время длительное повышение [Са2+]| приводит к гибели клеток (Berridge et al, 1998). Са2+ не может подвергаться метаболическим превращениям, как другие посредники, поэтому [Са"*], должна жестко регулироваться. В связи с этим, в клетках в процессе эволюции возникли системы белков, которые могут удерживать Са"' в связанном состоянии нли транспортировать его из клетки. Чтобы избежать создания высокой [Са2*],, опасной для клеток, концентрация свободного Са"* в покоящихся клетках поддерживается на очень низком уровне, в 1000-2000 раз меньшей, чем концентрация Са2* в наружной среде (1-2 мМ). Другим следствием жесткой регуляции [Са2*]; является то, что Са2* диффундирует очень медленно и на малые расстояния в цитоплазме. Установлено, что ион Са"* диффундирует на расстояние 0,1-0,5 мкМ до взаимодействия с Са2*-связывающим белком (Allbritton et al, 1992). Чтобы избежать с одной стороны проблему цитотоксичности высоких [Са2*],, а с другой - проблему медленной диффузии Са2* в цитоплазме, клетки выработали простой механизм сигнализации, основанный на генерации коротких импульсов [Са"*], (Са2*-спанков) (Berridge. 1993; Clapham, 1995а; Berridge, 1997а, 1997b).

Активация многих мембранных рецепторов приводит к двухфазному увеличению [Са2*], вследствие мобилизации Са2* из внутриклеточных депо и входа Са"т по градиенту концентрации из наружной среды (рис. 23). CaCI,

Добавление к клеткам агониста (agonist) вызывает двухфазный Са2+-сигнал: кратковременный пик, связанный с мобилизацией Са2+ из депо (release) и выраженное длительное «плато», обусловленное входом Са2* из наружной среды (influx).

Справа: агонист добавляется к клеткам, находящимся в бескальциевой среде и регистрируется фаза мобилизиации Са2+ из депо (release). Далее в среду вводится 2 мМ Са"* и регистрируется фаза входа Са2* в клетку (по Zhu, Birnbaumer, 1998).

5.2. Механизмы мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо

Все клетки млекопитающих, за исключением эритроцитов, содержат органеллы, способные аккумулировать Са"* против электрохимического градиента. При соответствующих условиях Са2+ выходит из этих депо медленно (из митохондрий, секреторных гранул) или быстро (из саркоплазматического ретикулума (CP) мышечных клеток, Са2*-депо немышечных клеток). Са2+-запасающие органеллы, способные к быстрому обмену кальцием с цитоплазмой, содержат Са"*-буферные системы и Са"-каналы, по которым Са"+ освобождается из депо. 5.2.1. Са2* - депо мышечных клеток

В мышечных клетках Са~*-депо служит СР. Различают свободные, продольные цистерны CP и терминальные цистерны, контактирующие с впячиваниями сарколеммы (цистернами Т-системы). Структурная гетерогенность CP определяется различными функциями его отделов: продольные цистерны поглощают Са"* из миоплазмы. Терминальные цистерны способны к выбросу Са"* в ответ на деполяризацию сарколеммы. Мембрана CP содержит Са2+-АТФазу (мол. масса 110 кДа), осуществляющую сопряжение гидролиза АТФ с переносом Cai+. Са2+-АТФаза составляет 90% белков CP и транспортирует Са~т в стехиометрии 2:1 по отношению к АТФ. Са"'-АТФаза является классическим интегральным мембранным белком, имеющим 10 трансмембранных а-спиральных сегментов (М1-М10). в цитоплазме расположены домены Са2+-АТФазы, участвующие в фосфорилировании и связывании нуклеотидов (АТФ) (Mac Lennan et al, 1997) (рис. 24). Специфический ингибитор SERCA Са+-АТФаз тапсигаргин связывается с тарансмембранным сегментом МЗ. В связывании Са"+ участвуют трансмембранные сегменты М4, М5 и Мб. При связывании 1 молекулы АТФ с цитоплазматическим нуклеотид-связывающим доменом Са2+-АТФазы через мембарну CP в полость депо транспортируются 2 иона Са2+ (Mac Lennan et al, 1997). Са"+-АТФаза CP сердечных, скелетных и гладких мышц регулируется кислым протеолипидом фосфоламбаном (мол. масса 25 кДа). Молекула фосфоламбана состоит из пяти идентичных протомеров (мол. массой около 5 кДа), тесно контактирующих друг с другом и пронизывающих мембрану СР. Фосфоламбан связывает АТФ в стехиометрии 1:1 и может фосфорилироваться как цАМФ-зависимой протеинкиназой, так и Са~'-кальмодулин-зависимой протеинкиназой. Дефосфорилированный фосфоламбан связан с Са"+-АТФазой и ингибирует ее активность. Фосфорилирование фосфоламбана приводит к его отделению и активации АТФазы (James et al, 1989). Са2"-АТФазы в CP являются продуктами двух различных генов: SERCA 1 и SERCA 2. SERCA 1 АТФазы экспрессированы в скелетных мышцах, a SERCA 2 АТФазы в сердечных и скелетных мышцах (Pozzan et al, 1994; Hussain, Inesi, 1999).

Белок кальсеквестрин (мол. масса 42 кДа) и Са^-связывающий белок с высоким сродством к Са~т (мол. масса 55 кДа) локализованы внутри цистерн СР. Кальсеквестрин, кислый растворимый белок, содержащий много остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, составляет до 20% всего белка в терминальных цистернах скелетных мыши. Кальсеквестрин связывает большую часть (а'', поступающего в терминальные цистерны при работе Са"1-АТФазы. Одна молекула кальсеквестрина способна связать 43 иона Са"+. Этот белок служит основным Са"+-буфером в СР. В скелетных мышцах кальсеквестрин находится только в терминальных цистернах, в непосредственной близости к рианодин-чувствительному Са2+-каналу (Pietrobon et al., 1990). Локализация кальсеквестрина объясняется его функцией: белок не только служит буфером для Са2+ внутри терминальных цистерн, но и концентрирует Са2+ около Са2+-каналов, увеличивая тем самым скорость освобождения Са2+.

Трансмембранный домен белка включаег 10 а-спиральных сегментов (М1-М10). В цитоплазме локализованы домены, участвующие в фосфорилировании (phosphorylation) и связывании нуклеотидов (nucteotide binding). В связывании Са"* участвуют трансмембранные сегменты М4, М5 и Мб (по Mac Lennan et al., 1997).

5.2.1.1. Биофизические характеристики и регуляция рианодин-чувствительных Са2+-каналов

Са^-каналы в мембранах терминальных цистерн, специфически связывающие растительный алкалоид рианодин, служат объектом интенсивных исследований. Выяснение электрофизиологических и биохимических характеристик этих Са"+-каналов важно для понимания связи между возбуждением и сокращением в мышцах. Алкалоид рианодин в концентрации 5-50 нМ увеличивает вероятность открытого состояния канала выброса Са21", а в микромолярных концентрациях блокирует канал (Bull et al, 1989).

Использование метода локальной фиксации потенциала позволило исследовать работу одиночных каналов Са"*-выброса после слияния пузырьков CP с бислойной липидной мембраной. Са2+-каналы имеют высокую проводимость для Са"1 (100 пСм) и низкую селективность для двухвалентных ионов по сравнению с одновалентными: РСа2+/Рк+=5. Са"+ (мкМ), АТФ (мМ) и инозитол-1,4,5-трисфосфат (1Р3) (мкМ), добавленные со стороны цитоплазмы, увеличивают время открытого состояния каналов в CP скелетных мышц. В результате совместного действия Са-" и АТФ канал может находиться в открытом состоянии длительное время. Каналу свойственны, по крайней мере, шесть закрытых и шесть открытых состояний, активируемых лигандами (Meissner, 1994).

Са2т-каналы в мембране CP активируются цитоплазматическим Са2+ (0,5-1,5 мкМ), АТФ (1-5 мМ), кофеином (мМ), 1Р3 (мкМ); ингибируются Mg2+ (мМ), рутениевым красным (мкМ) и La3+ (0,5 мМ) (Meissner, 1994; Xu et al, 1999). Эффективным ингибитором каналов Са2+-выброса в мембране CP является сфингозин (мкМ), длинноцепочечный аминоспирт, входящий в состав сфингомиелина (Sabbadini et al, 1992). Кальмодулин подавляет высвобождение Са2+ из CP и уменьшает время открытого состояния Са2*-каналов в отсутствие АТФ, что указывает на прямое ингибирующее действие кальмодулина на Са2+-каналы (Meissner, 1994). Рианодин-чувствительные Са2+-каналы блокируются также заряженными местными анестетиками и гелотермином, пептидным токсином из яда мексиканской бородатой ящерицы (Tinker, Williams, 1993). Императоксин А, пептидный токсин из яда скорпиона Pandinus imperator, прямо связывается с рианодиновым рецептором и активирует канал Са2+-выброса (Gurrola et al, 1999). В последнее время показано, что рианодин-чувствительные Са2*-каналы активируются сурамином (Sitsapesan, Williams, 1996; Sitsapesan, 1999).

Активность каналов Са"т-выброса в CP скелетных мышц регулируется аннексинами, относящимися к семейству Са~~- и фосфолипид-связывающих белков. Методами иммунофлуоресценции установлена связь аннексина VI (кальцимедина) (мол. масса 67 кДа) с СР. Аннексии VI в концентрации 5-40 нМ существенно изменяет воротные характеристики рианодин-чувствительных Са2+-каналов, изолированных из СР. Вероятность открытого состояния каналов увеличивается в 2,7 раза, а среднее время открытого состояния - в 82 раза (Hazarika et al, 1991).

В последнее время появились данные о том, что свободные жирные кислоты и их производные модулируют активность Са' '-каналов рианодиновых рецепторов в скелетных мышцах. Показано, что такие производные длинноцепочечных жирных кислот, как пальмитоилкарнитин и пальмитоил-КоА, в микромолярных концентрациях стимулируют связывание 'Н-рианодина и активируют каналы Са2*-выброса в CP скелетных мышц млекопитающих (El Hayek et al.,1993; Meissner, 1994) и птиц (Dumonteil et al., 1993). Этот эффект высокоспецифичен для скелетных мышц: пальмитоилкарнитин не влияет на связывание 3Н-рианодина с CP сердечных мышц собаки. Более того, только длинноцепочечные ацилкарнитины (Си, С,6, С!8) вызывают освобождение Са~* из CP и увеличивают время открытого состояния Са-каналов рианодиновых рецепторов (El-Hayek et al., 1993; Block, 1994). Предполагают, что пальмитоилкарнитин взаимодействует непосредственно с функционально важным участком Са"+-канала рианодинового рецептора и модулирует его воротные функции (El-Hayek et al., 1993). Возможно, что производные жирных кислот модулируют активность Са2+-каналов рианодиновых рецепторов при некоторых метаболических нарушениях и патологических состояниях мышц, при которых наблюдается повышение [Са"+], (Block, 1994; Meissner, 1994).

Активность Са"+-каналов рианодиновых рецепторов модулируется сульфгидрильными реагентами. Показано, что перекись водорода стимулирует освобождение Са"+ нз CP, окисляя SH-группы рианодинового рецептора (Favero et al., 1995). Алкилирование SH-групп рианодинового рецептора при действии N-этилмалеимида приводит к активации Са~+-каналов рианодинового рецептора в мембране CP (Aghdasi et al., 1997; Zhang et al., 1999). Установлено также, что окисление SH-групп белка Са2+-канала блокирует связывание кальмодулина с рианодиновым рецептором. Предполагают, что кальмодулин может защищать рианодиновый рецептор от окислительных модификаций во время окислительного стресса (Zhang et al., 1999). Рианодиновые рецепторы из сердца овцы, встроенные в бислойную липидную мембрану, активируются окисляющими реагентами 4,4'-дитиодипиридином и тимеросалом (Eager, Dufhunry, 1998, 1999).

Одиночный канал Са2*-выброса в клетках сердечной мышцы более чувствителен к Са"+ и менее чувствителен к АТФ, чем канал в скелетных мышцах. Алкалоид рианодин в концентрации 5-50 нМ увеличивает вероятность открытого состояния канала Са~'-выброса, а в микромолярных концентрациях блокирует канал (Meissner, 1994). На основании исследования селективности каналов Са"+-выброса для одновалентных и двухвалентных катионов до и после модификации рианодином, предложена следующая модель Са2*-канапа в CP клеток сердца (Lindsay et al., 1994). Каналы проницаемы для одновалентных (К+, Na*, Cs+, Li+), двухвалентных (Ва~*, Sr+) и органических одновалентных (этиламин, пропаноламин, диэтиламин) катионов. В Са~'-канале выделяют следующие участки: за устьем канала, обращенным в полость депо, расположен селективный фильтр радиусом 0,35 нм; гидрофобный участок связывания катионов; в середине поры локализован гидрофильный (содержащий СОО- группы) участок связывания одновалентных и двухвалентных катионов; участок связывания больших органических катионов; устье, обращенное в цитоплазму. Рианодин увеличивает размер селективного фильтра на 0,02-0,03 нм; увеличивает плотность отрицательных зарядов в поре; повышает сродство гидрофильного участка связывания к одновалентным и двухвалентным катионам (Lindsay et al, 1994).

5.2.1.2. Структура рианодииового рецептора

Использование рианодина позволило выделить канал выброса Са2+ из скелетных и сердечных мышц (Lai et al, 1988). Показано, что рианодиновый рецептор, реконструированный в бислойную липидную мембрану, функционирует как канал выброса Са2" с характеристиками, сходными с таковыми Са" -каналов из мембран СР. Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что рианодиновый рецептор образует гомотетрамерный комплекс (Lai et al, 1988). Трехмерная структура рецептора напоминает четырехлепестковый лист клевера, сходный с описанными ранее структурами типа "ножка", связывающих в мышце цистерны Т-системы и терминальные цистерны.

Методами молекулярного клонирования установлена аминокислотная последовательность рианодииового рецептора из CP скелетных мышц кролика (Takeshima et al, 1989) и человека (Zorzato et al, 1990), а также сердечных мышц кролика (Otsu et al, 1990). Наиболее изученным является рианодиновый рецептор из скелетных мышц кролика. Каждая из четырех субъединиц этого рецептора состоит из 5037 аминокислотных остатков (общая мол. масса 565 кДа) (рис 25). Показано

что только 500 аминокислот с С-конца рецептора являются достаточно гидрофобными для пронизывания мембраны. Четыре предполагаемых трансмембранных сегмента (М1-М4), выделяемых в этой области, сходны с пронизывающими мембрану сегментами субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора, что свидетельствует о возможной локализации в этом участке водной поры, образуемой аминокислотными остатками С-концов каждого из мономеров рианодииового рецептора. 90% аминокислот N-конца рецептора являются гидрофильными и образуют, по-видимому, структуру типа "ножка" (Takeshima et al, 1989) (рис. 25). Если рианодиновый рецептор, ножка и канал выброса Са"* входят в состав одного белка, а дигндропиридиновые рецепторы (Са"+-каналы) в цистернах Т-системы являются сенсорами напряжения, то, возможно, большой гидрофильный участок (ножка) рианодииового рецептора непосредственно взаимодействует с цитоштазматическим участком дигидропиридинового рецептора, обеспечивая тем самым электромеханическое сопряжение мембран (Takeshima et al., 1989; Pietrobon et al., 1990) (рис. 26). Таким образом, в скелетных мышцах информация передается по механизму конформационного связывания (conformational coupling) (Klein et al., 1996). Активация дигидропиридинового рецептора приводит к изменению его конформации, которое передается рианодиновому рецептору и стимулирует открывание каналов Са"*-выброса (Berridge, 1993; Clapham, 1995а; Klein et al., 1996)). Обнаружено также, что рианодиновый рецептор может посылать ретроградный сигнал, активирующий дигидропиридиновый рецептор (Nakai et al., 1996).

Рис. 25. Топология субъединицы рианодинового рецептора в мембране саркоплазматического ретикулума.

Четыре трансмембранных сегмента локализованы около С-конца молекулы. Участки D1-D3 наиболее вариабельны у трех изоформ рианодинового рецептора. В цитоплазматическом фрагменте рецептора показаны участки связывания императоксина A (imperatoxin А), кальмодулина (calmodulin) и FK-связывающего белка (FKBP).

Cytoplasm -цитоплазма; Lumen of SR - полость саркоплазматического ретиулума (по Stokes, Wagenknecht, 2000).

В сердечных мышцах дигидропиридиновый рецептор не взаимодействует непосредственно с рианодиновым рецептором и сопряжение между возбуждением и сокращением осуществляется по механизму Са~1-индуцированного выброса Са~+ (Cannell et al, 1995). Активация дигидропиридинового рецептора приводит к входу Са2+, который стимулирует рианодин-чувствительные Са~"-каналы.

Рис. 26. Модель связи возбуждения и сокращения (excitation-contraction coupling) в скелетных мышцах.

Большой гидрофильный участок (ножка) рианодииового рецептора (RyR) непосредственно взаимодействует с цитоплазматическим участком дигидропиридинового рецептора (Са" -канала), обеспечивая тем самым электромеханическое сопряжение мембран. Триадин и кальсеквестрин -белки CP (no Marks, 1997).

Каждая субьединица рианодииового рецептора взаимодействует с РК506-связывающим белком (мол. масса 12 кДа) (Jayaraman et al, 1992; Striggow. Ehrlich, 1996a; Marks, 1997) (рис. 26). РК506-связывающие белки (FKBPs) представляют собой иммунофилины, которые первоначально были идентифицированы как агенты, связывающие структурно сходные иммунодепрессанты FK.506 и рапамицин. По-видимому, FKBPs стабилизируют активность CaJH -канала рианодииового рецептора (Brillantes et al, 1994). Иммунодепрессанты FK506 и рапамицин вызывают диссоциацию FKBP от рианодииового рецептора и модулируют активность каналов Са" -выброса в скелетных и сердечных мышцах. Наблюдается увеличение вероятности открытого состояния и уменьшение проводимости одиночных Са"" -каналов (Kaftan et а/, 1996; Striggow, Ehrlich, 1996а; Marks, 1997). Рапамицин и FK506 содержат макроциклическое лактонное кольцо. Обнаружено, что другие соединения (ивермектин, мидекамицин), содержащие макроциклическое лактонное кольцо, также могут прямо активировать рианодиновый рецептор (Ahem et al., 1999).

В настоящее время семейство рианодиновых рецепторов (RYR) включает три изоформы: RYR1, найденный в скелетных мышцах и некоторых нейронах (например, в клетках Пуркинье); RYR2, идентифицированный в сердечных мышцах и мозге; RYR3, найденный в гладких мышцах, мозге и других клетках (Meissner, 1994; Bennett et al., 1996).

5.2.2. Са2+-депо немышечных клеток

В немышечных клетках кальциевые депо отличаются большей сложностью и разнообразием (Pozzan et al., 1994). 1Р3 освобождает Ca2+ из немитохондриального пула, сходного с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) (Streb et al., 1983; Berridge, Irvine, 1984; Berridge, 1993). Однако только часть Са2+-пула немышечных клеток чувствительна к 1Р3; в среднем 1Р3 освобождает примерно 30-50% Са"+, запасенного в немитохондриальном пуле, а остальная часть Са2+ мобилизуется при действии Са**-ионофоров (Berrige, Irvine, 1989). Многие немышечные клетки содержат Са_+-депо, не чувствительные к 1Р3, но, как и CP мышц, чувствительные к рианодину и кофеину (Berridge, Irvine, 1989; Pozzan et al., 1994).

В последнее время сложилось представление о том, что ключевую роль в генерации и проведении Са2*-сигналов в невозбудимых клетках играют такие внутриклеточные органеллы, как ЭР, ядро, митохондрии (Pozzan et al., 1994; Meldolesi, Pozzan, 1998: Alvarez et al., 1999; см. обз. Крутецкая, Лебедев, 2001). Для измерения концентрации Са2+ во внутриклеточных депо используются флуоресцентный Са^+-зонд Mag-Fura 2-АМ и Са2+-чувствительный белок экворин (Meldolesi, Pozzan, 1998; Alvarez eta!., 1999).

Основным 1Р3-чувствительным Са"+-депо является ЭР или его специализированный субкомпартмент (капьциосома). ЭР способен накапливать большие концентрации Са~" и затем быстро освобождать Са2+ в цитозоль (рис. 27). Общая концентрация Са2+ в ЭР составляет 5-10 мМ (Pozzan et al., 1994; Montero et al., 1995; Meldolesi, Pozzan, 1998). Большая часть Ca2+ в ЭР связана с кальретикулином и другими Са2+-связывающими белками. Концентрация свободного Са"т в полости ЭР различных типов клеток в состоянии покоя составляет 300-800 мкМ (Alonso et a

l., 1998; Alvarez et al, 1999). Прямое измерение концентрации Са" в ЭР позволило оценить скорости выхода Са2" из депо и восполнения ЭР (Barrero et al, 1997; Mogami et al, 1998; Alvarez et al, 1999).

Обнаружено также, что Са2т играет решающую роль во многих процессах, протекающих в ядре: транскрипции генов, синтезе ДНК, разрушении и репарации ядерной мембраны (Berridge, 1995b; Gerasimenko et al, 1996; Santella, 1996). Использование экворина показало, что концентрация Са"+ в нуклеоплазме в покое близка к концентрации Са"* в цитозоле (100-200 нМ) (Petersen, 1996). После стимуляции клеток Ca"h быстро диффундирует из цитозоля в ядро через ядерные поры. Увеличение концентрации Са2+ в ядре происходит через 50-300 мс после повышения [Са2+]; (Allbritton et al, 1994). Ядерная оболочка является продолжением ЭР, способна аккумулировать Са"т и затем освобождать его в ответ на воздействие 1Р3 (рис. 27). Установлено, что Са*т-АТФазы локализованы в наружной ядерной мембране, а 1Р3-чувствительные Са~+-каналы - во внутренней ядерной мембране (Gerasimenko et al, 1996). Предполагают, что 1Р3-рецепторы в ядре могут активироваться 1Р3, образующимся в самом ядре в результате стимуляции эндогенного фосфоинозитидного цикла (Berridge, 1995b).

Гистамин

Рис. 27. Перераспределение Са2+ в митохондрии, ядре и эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) при стимуляции клетки 1Р3-мобилизующими агонистами (гистамин, ацетилхолин (АХ)) (по Alvarez etal., 1999). Инкубация клеток HeLa в бескальциевой среде способствует быстрому уменьшению концентрации Са"+ в ЭР в течение 3 мин при 37 °С или в течение 12 мин при 22 °С. Ингибирование Са~*-АТФаз уменьшает время опустошения депо до 1-2 мин (Barrero et al., 1997). Полное восполнение ЭР после добавления Са" в наружную среду происходит в различных типах клеток за 2-3 мин при 37 °С и за 5-8 мин при 22 °С (Barrero et al., 1997; Alonso et al., 1998; Mogami et al., 1998; Alvarez et al.,

1999).

В последние годы возобновился интерес исследователей к выяснению роли митохондрий в процессах Са" -сигнализации. Учитывая, что повышение [Са~*], может стимулировать активность ключевых ферментов митохондрий, предполагают, что обратимый захват Са"~ митохондриями может координировать продукцию энергии в клетке (Gunter et al., 1994). Относительно недавно разработаны новые флуоресцентные Са2*-зонды (RHOD 2 и др.), которые можно вводить избирательно в митохондрии живых клеток, и проводить одновременную регистрацию изменений концентрации свободного Са"* в цитозоле и в митохондриях. Установлено, что концентрация Са'4 в митохондриях в покое соответствует таковой в цитозоле (Rizzuto et al., 1998). Для некоторых типов клеток было показано, что митохондрии являются активными участниками внутриклеточной Са2н-сигнализации, уникальная роль которых определяется способностью митохондрий быстро аккумулировать и затем освобождать большие концентрации Са~* (Robb-Gaspers et al., 1998; Ricken et al., 1998; Duchen, 1999; Drummond et al.,

2000). Так, оказалось, что митохондрии могут захватывать Са~* из микродоменов с локально высокой концентрацией Са~+ в цитозоле, связанной с входом Са2н из наружной среды или мобилизацией Са"* из депо (Rizzuto et al. • 1993, 1994, 1998; Rutter et al., 1993; Lawrie et al., 1996; Babcock et al., 1997; Babcock, Hille, 1998). Ранее на клетках асцитной карциномы Эрлиха было показано, что при активации АТФ-рецептора этих клеток митохондрии временно захватывают 25-30% выходящего из ЭР Са2+. При этом меняется активность некоторых ферментов окислительного фосфорилирования. Выход Са" из митохондрий интактных клеток подавляется тетрафенилфосфонием (Gukovskaya, Zinchenko, 1990).

Интересно, что распределение митохондрий в клетке далеко не случайно и связано с ее метаболическими потребностями. Например, в эндотелиальных клетках линии ECV304 менее 4%. а в клетках линии HeLa 65% митохондрий расположены на расстоянии 700 нм от ЭР. В то же время, в клетках ECV304 14%, а в клетках HeLa менее 6% митохондрий находятся на расстоянии 700 нм от плазматической мебраны (Lawrie et al., 1996). В клетках HeLa митохондрии образуют большую взаимосвязанную тубулярную сеть, имеющую многочисленные тесные контакты с ЭР (Rizzuto et al, 1998). Функциональным следствием этой анатомической организации является то, что при освобождении Са2' из ЭР, концентрация Са"* вблизи митохондрий существенно выше, чем в цитозоле (Rizzuto et al, 1998). В гладкомышечных клетках (ivlcCarron, Muir, 1999), кардиомиоцитах и астроцитах (Duchen, 1999) митохондрии также расположены в непосредственной близости к ЭР/СР.

Следует специально отметить серию работ Хилле и соавторов (Herrington et al, 1996; Park et al, 1996; Babcock et al, 1997; Babcock. Hille, 1998) на хромаффинных клетках надпочечника крысы. Одновременное измерение [Са2+]; и концентрации Са2+ в митохондриях показало, что даже средние увеличения [Ca"+]j вызывают быстрые кратковременные перераспределения Са~+ из цитозоля в митохондрии. Обнаружено также, что захват Са"* митохондриями ограничивает подъем и определяет быстрый спад Са"*-сигналов, вызванных входом Са"* в клетку или мобилизацией Са"+ из депо. Последующий экспорт Са"+ из митохондрий происходит с участием №+/Са"*-обменника во внутренней мембране митохондрий и может замедлить спад Са~*-сигналов в цитозоле и способствовать восполнению Са"+-депо. Авторы предполагают, что митохондрии играют активную и уникальную роль в процессах Са"+-сигнализации в хромаффинных клетках крысы. Плазматическая мембрана и внутриклеточные Са"+-депо быстро доставляют Са"' в цитоплазму, открывая ионные каналы, и затем медленно удаляют его с помощью процессов первичного (Са2+-АТФ-аза) и вторичного активного транспорта (Na7Ca"-обмен). Напротив, митохондрии в соответствии с их происхождением как симбионтов внутри цитоплазмы эукариот быстро удаляют Са"* из цитозоля с помощью Са~+-унипортера, который действует как канал во внутренней мембране митохондрий, и затем более медленно экспортируют Са2+ в цитозоль с участием вторично-активного

роли митохондрий в процессах Са" -сигнализации. Учитывая, что повышение [Са~*], может стимулировать активность ключевых ферментов митохондрий, предполагают, что обратимый захват Са"~ митохондриями может координировать продукцию энергии в клетке (Gunter et al., 1994). Относительно недавно разработаны новые флуоресцентные Са2*-зонды (RHOD 2 и др.), которые можно вводить избирательно в митохондрии живых клеток, и проводить одновременную регистрацию изменений концентрации свободного Са"* в цитозоле и в митохондриях. Установлено, что концентрация Са'4 в митохондриях в покое соответствует таковой в цитозоле (Rizzuto et al., 1998). Для некоторых типов клеток было показано, что митохондрии являются активными участниками внутриклеточной Са2н-сигнализации, уникальная роль которых определяется способностью митохондрий быстро аккумулировать и затем освобождать большие концентрации Са~* (Robb-Gaspers et al., 1998; Ricken et al., 1998; Duchen, 1999; Drummond et al.,

2000). Так, оказалось, что митохондрии могут захватывать Са~* из микродоменов с локально высокой концентрацией Са~+ в цитозоле, связанной с входом Са2н из наружной среды или мобилизацией Са"* из депо (Rizzuto et al. • 1993, 1994, 1998; Rutter et al., 1993; Lawrie et al., 1996; Babcock et al., 1997; Babcock, Hille, 1998). Ранее на клетках асцитной карциномы Эрлиха было показано, что при активации АТФ-рецептора этих клеток митохондрии временно захватывают 25-30% выходящего из ЭР Са2+. При этом меняется активность некоторых ферментов окислительного фосфорилирования. Выход Са" из митохондрий интактных клеток подавляется тетрафенилфосфонием (Gukovskaya, Zinchenko, 1990).

Интересно, что распределение митохондрий в клетке далеко не случайно и связано с ее метаболическими потребностями. Например, в эндотелиальных клетках линии ECV304 менее 4%. а в клетках линии HeLa 65% митохондрий расположены на расстоянии 700 нм от ЭР. В то же время, в клетках ECV304 14%, а в клетках HeLa менее 6% митохондрий находятся на расстоянии 700 нм от плазматической мебраны (Lawrie et al., 1996). В клетках HeLa митохондрии образуют большую взаимосвязанную тубулярную сеть, имеющую многочисленные тесные контакты с ЭР (Rizzuto et al, 1998). Функциональным следствием этой анатомической организации является то, что при освобождении Са2' из ЭР, концентрация Са"* вблизи митохондрий существенно выше, чем в цитозоле (Rizzuto et al, 1998). В гладкомышечных клетках (ivlcCarron, Muir, 1999), кардиомиоцитах и астроцитах (Duchen, 1999) митохондрии также расположены в непосредственной близости к ЭР/СР.

Следует специально отметить серию работ Хилле и соавторов (Herrington et al, 1996; Park et al, 1996; Babcock et al, 1997; Babcock. Hille, 1998) на хромаффинных клетках надпочечника крысы. Одновременное измерение [Са2+]; и концентрации Са2+ в митохондриях показало, что даже средние увеличения [Ca"+]j вызывают быстрые кратковременные перераспределения Са~+ из цитозоля в митохондрии. Обнаружено также, что захват Са"* митохондриями ограничивает подъем и определяет быстрый спад Са"*-сигналов, вызванных входом Са"* в клетку или мобилизацией Са"+ из депо. Последующий экспорт Са"+ из митохондрий происходит с участием №+/Са"*-обменника во внутренней мембране митохондрий и может замедлить спад Са~*-сигналов в цитозоле и способствовать восполнению Са"+-депо. Авторы предполагают, что митохондрии играют активную и уникальную роль в процессах Са"+-сигнализации в хромаффинных клетках крысы. Плазматическая мембрана и внутриклеточные Са"+-депо быстро доставляют Са"' в цитоплазму, открывая ионные каналы, и затем медленно удаляют его с помощью процессов первичного (Са2+-АТФ-аза) и вторичного активного транспорта (Na7Ca"-обмен). Напротив, митохондрии в соответствии с их происхождением как симбионтов внутри цитоплазмы эукариот быстро удаляют Са"* из цитозоля с помощью Са~+-унипортера, который действует как канал во внутренней мембране митохондрий, и затем более медленно экспортируют Са2+ в цитозоль с участием вторично-активного

роли митохондрий в процессах Са" -сигнализации. Учитывая, что повышение [Са~*], может стимулировать активность ключевых ферментов митохондрий, предполагают, что обратимый захват Са"~ митохондриями может координировать продукцию энергии в клетке (Gunter et al., 1994). Относительно недавно разработаны новые флуоресцентные Са2*-зонды (RHOD 2 и др.), которые можно вводить избирательно в митохондрии живых клеток, и проводить одновременную регистрацию изменений концентрации свободного Са"* в цитозоле и в митохондриях. Установлено, что концентрация Са'4 в митохондриях в покое соответствует таковой в цитозоле (Rizzuto et al., 1998). Для некоторых типов клеток было показано, что митохондрии являются активными участниками внутриклеточной Са2н-сигнализации, уникальная роль которых определяется способностью митохондрий быстро аккумулировать и затем освобождать большие концентрации Са~* (Robb-Gaspers et al., 1998; Ricken et al., 1998; Duchen, 1999; Drummond et al.,

2000). Так, оказалось, что митохондрии могут захватывать Са~* из микродоменов с локально высокой концентрацией Са~+ в цитозоле, связанной с входом Са2н из наружной среды или мобилизацией Са"* из депо (Rizzuto et al. • 1993, 1994, 1998; Rutter et al., 1993; Lawrie et al., 1996; Babcock et al., 1997; Babcock, Hille, 1998). Ранее на клетках асцитной карциномы Эрлиха было показано, что при активации АТФ-рецептора этих клеток митохондрии временно захватывают 25-30% выходящего из ЭР Са2+. При этом меняется активность некоторых ферментов окислительного фосфорилирования. Выход Са" из митохондрий интактных клеток подавляется тетрафенилфосфонием (Gukovskaya, Zinchenko, 1990).

Интересно, что распределение митохондрий в клетке далеко не случайно и связано с ее метаболическими потребностями. Например, в эндотелиальных клетках линии ECV304 менее 4%. а в клетках линии HeLa 65% митохондрий расположены на расстоянии 700 нм от ЭР. В то же время, в клетках ECV304 14%, а в клетках HeLa менее 6% митохондрий находятся на расстоянии 700 нм от плазматической мебраны (Lawrie et al., 1996). В клетках HeLa митохондрии образуют большую взаимосвязанную тубулярную сеть, имеющую многочисленные тесные контакты с ЭР (Rizzuto et al, 1998). Функциональным следствием этой анатомической организации является то, что при освобождении Са2' из ЭР, концентрация Са"* вблизи митохондрий существенно выше, чем в цитозоле (Rizzuto et al, 1998). В гладкомышечных клетках (ivlcCarron, Muir, 1999), кардиомиоцитах и астроцитах (Duchen, 1999) митохондрии также расположены в непосредственной близости к ЭР/СР.

Следует специально отметить серию работ Хилле и соавторов (Herrington et al, 1996; Park et al, 1996; Babcock et al, 1997; Babcock. Hille, 1998) на хромаффинных клетках надпочечника крысы. Одновременное измерение [Са2+]; и концентрации Са2+ в митохондриях показало, что даже средние увеличения [Ca"+]j вызывают быстрые кратковременные перераспределения Са~+ из цитозоля в митохондрии. Обнаружено также, что захват Са"* митохондриями ограничивает подъем и определяет быстрый спад Са"*-сигналов, вызванных входом Са"* в клетку или мобилизацией Са"+ из депо. Последующий экспорт Са"+ из митохондрий происходит с участием №+/Са"*-обменника во внутренней мембране митохондрий и может замедлить спад Са~*-сигналов в цитозоле и способствовать восполнению Са"+-депо. Авторы предполагают, что митохондрии играют активную и уникальную роль в процессах Са"+-сигнализации в хромаффинных клетках крысы. Плазматическая мембрана и внутриклеточные Са"+-депо быстро доставляют Са"' в цитоплазму, открывая ионные каналы, и затем медленно удаляют его с помощью процессов первичного (Са2+-АТФ-аза) и вторичного активного транспорта (Na7Ca"-обмен). Напротив, митохондрии в соответствии с их происхождением как симбионтов внутри цитоплазмы эукариот быстро удаляют Са"* из цитозоля с помощью Са~+-унипортера, который действует как канал во внутренней мембране митохондрий, и затем более медленно экспортируют Са2+ в цитозоль с участием вторично-активного

трансмембранные участки важны для объединения субъединиц рецептора в тетрамеры и образуют, по-видимому, канал выброса Са_+. Показано, что для олигомеризации рецептора особую значимость имеют пятый и шестой трансмембранные участки (Galvan et al., 1999).

Обнаружено также, что в образовании поры Са~т-канала принимает участие последовательность из 190 аминокислот (включающая пятый и шестой трансмембранные сегменты) в области С-конца 1Р3-рецепТора (Ramos-Franco et al., 1999). Напротив, участок связывания IP, расположен на N-конце рецептора, содержащем много остатков аргинина и лизина. Таким образом, каждая субъединица гомотетрамера 1Р3-рецептора содержит независимый лигандсвязывающий участок, локализованный на N-конце каждой субъединицы и отделенный от образующих Са~+-канал трансмембранных участков более чем 1400 аминокислотами.

После связывания 1Р3 происходит значительная конформационная перестройка рецептора, приводящая к активации канала. По доменной модели 1Р3-рецептора субъединицы рецептора взаимодействуют с помощью нековалентных связей субъединиц в области С-концов, содержащих трансмембранные фрагменты. Эти фрагменты в большой степени гомологичны рианодиновому рецептору и образуют, по-видимому, управляемый Са^-канал. Аминокислотная последовательность между 1Р3-связывающим доменом и Са2+-каналом служит мишенью для регуляторных факторов, так как участок цАМФ-зависимого фосфорилирования рецептора расположен, по-видимому, в этой области. Предполагают, что участками фосфорилирования 1Р3-рецептора цАМФ-зависимой протеинкиназой являются остатки серина в положениях 1755 и 1589 (Mignery, Sudhof, 1990).

В настоящее время семейство 1Р3-рецепторов включает три изоформы. Наиболее распространенной изоформой является 1Р3-рецептор I типа, который идентифицирован в мозге (мозжечке), гладких и скелетных мышцах, Т-лимфоцитах, клетках сердца, ооцитах Xenopus. 1Р3-рецептор 2 типа клонирован из мозжечка крысы; его аминокислотная последовательность на 69 % идентична таковой 1Р3-рецептора 1 типа. 1Р3-рецептор 3 типа экспрессирован в эпителии кишечника и на 64 % идентичен по аминокислотной последовательности 1Р3-рецептору 1 типа (Marshall, Taylor, 1993; Bezprozvanny, Ehrlich, 1995; Marks, 1997). 5.2.2.2. Регуляция активности 1 Р3-рецептора

IP,-рецепторы являются мишенями для многих аллостерических регуляторов: протеинкиназ. адениновых нуклеотидов, двухвалентных катионов, связанных белков.

Наиболее эффективным из известных агонистов (активаторов) 1Р3-рецепторов является аденофостин А, выделяемый из Penicillium brevicompactum. Сродство аденофостина А к 1Р3-рецептору в 100 раз выше, чем у самого 1Р3 (DeLisle et al, 1997).

Ингибиторами 1Р3-рецепторов служат гепарин (Supattapone et al, 1988b), кофеин (Missiaen et al, 1992a, 1992b) и этанол (Berridge, 1993). Mg2+ ингибирует как связывание IP3 с рецептором, так и 1Р3-индуцированный выброс Са2" (Marshall, Taylor, 1993). В последнее время обнаружено, что эффективным ингибитором 1Р3-рецепторов является проникающий через мембрану ксестоспонгин С (xestospongin С) (Gafni et al, 1997).

Выделенный из мозжечка 1Р3-рецептор может быть фосфорилирован цАМФ-зависимой протеинкиназой, протеинкиназой С и Са"-кальмодулин-зависимой протеинкиназой 2 (Marshall, Taylor, 1993). Эти ферменты фосфорилируют 1Р3-рецептор, добавляя один фосфатный остаток на молекулу белка. Фосфорилирующая активность трех протеинкиназ аддитивна: в присутствии смеси протеинкиназ 1Р3-рецептор получает три фосфатных остатка. Два потенциальных участка фосфорилирования протеинкиназой А обнаружены в 1Р3-рецепторах 1 и 2 типа (Mignery et al, 1990; Marshall, Taylor, 1993). В одних типах клеток протеинкиназа А потенциирует 1Р3-стимулируемый выброс Са2+, в то время как в других типах клеток фосфорилирование 1Р3-рецептора протеинкиназой А ингибирует Са2"'-каналы (Supattapone et al, 1988а; Marshall, Taylor, 1993; Tertyshnikova, Fein, 1998). Фосфорилирование протеинкиназой С 1Р3-рецепторов, локализованных в ядре, ускоряет 1Р3-чувствительный выброс Са2" (Matter et al, 1993). Обнаружено, что 1Р3-рецептор фосфорилируется также цГМФ-зависимой протеинкиназой (Komalavilas, Lincoln, 1994, 1996).

В структуре 1Р3-рецептора 1 типа идентифицированы два участка фосфорилирования по тирозину: один (Туг-482) расположен около N-конца, а другой (Туг-2617) - около предполагаемой поры Са~+-канала в области С-конца рецептора. Показано, что при активации Т-лимфоцитов происходит фосфорилирование 1Р3-рецепторов по остаткам тирозина, что может играть роль в модуляции активности 1Р3-чувствительных каналов Са2т-выброса (Harnick et al, 1995; Jayaraman et al, 1996; Marks, 1997). Обнаружено, что антиген-специфнческая стимуляция рецепторного комплекса Т-клеток вызывает ассоциацию нерецепторной тирозинкиназы Fyn с 1Р3-рецептором, фосфорилирование по тирозину 1Р3-рецептора и увеличение вероятности открытого состояния каналов Са2*-выброса (Jayaraman et al., 1996; Marks, 1997).

Нейрохимия - Ашмарин

Механизмы внутриклеточной сигнализации - Крутецкая

Роль ионного транспорта ГМК – Афиногенова

Клиническая биохимия - Ткачук

Дата добавления: 2014-01-11