Альтернативный путь активации

В 1954 г. Л. Пиллимер и соавт. сообщили о том, что препарат клеточных стенок дрожжей, зимозан, инактивирует С3 при инкубации с сывороткой (37^оС), не влияя на содержание С1, С4, С2, т.е. факторов классического каскада. Это означало, что кроме известного механизма активации комплемента, запускаемого иммунными комплексами через С1® С4®С2, существует иной (альтернативный) путь, который не зависит от антител. Сообщение было настолько неожиданным, что в него не поверили. Открытие Л. Пиллимера было забыто почти на 15 лет, и лишь после исследований, проведенных на других моделях, альтернативный механизм получил признание. Его инициация и развитие определяется взаимодействием факторов С3b, B, D, P, H и I.

С иммунологической точки зрения, альтернативный путь активации комплемента (АПАК) является одним из механизмов врожденного (неспецифического) иммунитета. АПАК менее эффективен, чем классический каскад, однако играет важную роль в защите от инфекций, обеспечивая подключение комплемента на «доиммунном» этапе, т.е. до появления антител. Известно множество активаторов АПАК: полисахариды, липополисахариды, вирусы, грибы, бактерии, клетки животных и паразитов. Их общим действующим началом скорее всего служит углеводный компонент.

Процесс начинается с фиксации С3 фактора на активирующей поверхности. Для объяснения химизма этой реакции потребовалось по-новому взглянуть на свойства некоторых белков. Оказалось, что в составе С3 имеется высокореактивный центр, который представлен тиоэфирной связью, конформационно заэкранирован в натитвной молекуле, но раскрывается после ее протеолитического расщепления, получая (в составе С3b-фрагмента) способность к ковалентному связыванию с гидроксильными и аминогруппами (рис. 3)1. Это первое условие, определяющее потенциальную активность С3 фактора в инициации АПАК. Вторая функция С3, обязательная для продолжения альтернативного каскада, состоит в том, что С3b, фиксированный на активаторах, участвует в построении С3-конвертазы, запуская цепную реакцию собственного воспроизводства.

Важным признаком тиоэфирной связи является нестабильность (или метастбильность). Она моментально взаимодействует с водой, подвергаясь гидролизу, так что полупериод ее «активной жизни» (т.е. способности к химическим реакциям) составляет всего 60 mсек. Поэтому из всех С3b-молекул на мишени фиксируются только те, которые находятся в непосредственной близости от нее. Это один из радикальных механизмов, препятствующих беспорядочному распылению С3b и случайной агрессии против собственных тканей.

Рис. 3. Связывание С3 (С3b) с активирующей поверхностью. Расщепление С3-конвертазами обнажает нестабильную тиоэфирную связь в составе С3b. Вступая во взаимодействие с соседними гидроксильными и аминогруппами, она образует ковалентные связи с углеводами и белками. Если этого не происходит (С3b остается в жидкой фазе), тиоэфирная группа моментально блокируется водой. Это лишает С3b биологической активности, останавливая активацию АПАК (D.M.Weir, J.Stewart. Immunology. 8^th ed. Churchill & Livingstone. 1997).

Концепция об инициаторной функции С3b фактора в системе АПАК предполагает его образование до внесения активирующих субстратов. Наиболее вероятна следующая версия. Тиоэфирная связь, будучи нестабильной, подвергается спонтанному (самопроизвольному) гидролизу в составе интактных молекул (это называется «холостой активацией» альтернативного каскада). Молекулы С3 с гидролизованной тиоэфирной связью (С3[Н₂О]), или С3i) по ряду признаков сходны с «настоящим» С3b. Сталкиваясь с адекватным (активирующим) объектом, они ковалентно связываются с ОН- и NH₂-группами активирующей поверхности и рецептируют фактор В, предрасполагая к образованию «запускающей» С3-конвертазы (рис. 4). Она атакует С3, вызывая образование первой порции С3b, который после фиксации на активаторе продолжает процесс.

Рис. 4. Механизм, запускающий активацию альтернативного каскада комплемента. Фактор С3 подвергается медленному гидролизу водой с образованием С3[H₂O] (С3i), который в присутствии ионов Mg2+ связывает фактор В. Фактор D расщепляет фактор В с образованием (после удаления пептида Ва) комплекса С3biBb. Он выполняет функцию “запускающей” С3-конвертазы, расщепляя С3 на фрагменты С3а и С3b. Если рядом имеет подходящий объект (актививрующая поверхность), С3b ковалентно связывается с ним (см. рис. 3), продолжая активационный процесс (см. рис. 5). Ферментативные реакции (ограниченный протеолиз) отмечены толстыми стрелками (D.M.Weir, J.Stewart. Immunology. 8^th ed. Churchill & Livingstone. 1997; с изменениями).

.

События развиваются по следующей схеме. С3b (на “запускающем” этапе С3[H₂O]) в присутствии ионов Mg²⁺ рецептирует фактор В. Это обнажает участок молекулы В, который служит мишенью для специфической протеазы, фактора D1. Он присутствует в плазме в готовой форме (т.е. не требует активации) и, атакуя единственную пептидную связь (Arg-Lys), отщепляет от фактора В небольшой фрагмент, Ва. Более крупный фрагмент (Bb) остается в связке с С3b, образуя бимолекулярный комплекс, действующий как С3-конвертаза альтернативного пути, С3bBb (на “запускающем” этапе С3[H₂O]Bb). Ее активный (протеазный) центр расположен на молекуле Вb, но сам по себе Bb не способен расщеплять С3: он активен только в сочетании с С3b. Это объясняется тем, что в составе С3-конвертазы С3b обеспечивает связывание новых молекул С3 и, меняя их конформацию, обнажает пептидную связь, чувствительную к Bb-протеазе2. Новые молекулы С3b могут самостоятельно фиксироваться на объекте, запуская собственный С3-конвертазный цикл. В условиях нелимитированного снабжения факторами С3 и В (их концентрация в сыворотке достаточно высока, соответственно 1,2 мг/мл и 0,2 мг/мл) и многократного использования фактора D это ведет к лавинообразному усилению процесса. Это так называемая «петля амплификации», которая существенно повышает эффективность комплемента (рис. 5)3.

Л. Пиллимером был предложен новый термин – «пропердин» (от лат. perdere – разрушать, properdere – готовить к разрушению). Отсюда и альтернативный путь первоначально именовался «пропердиновым». Позже оказалось, что фактор Р (акроним пропердина) не играет принципиальной роли, а лишь повышает эффективность АПАК. Его главная функция – стабилизация С3-конвертазы. Связываясь с комплексом С3bВb, фактор Р снижает скорость его распада и тем самым усиливает активацию АПАК (рис. 5). По инерции (или незнанию) пропердин до сих пор нередко включают в перечень самостоятельных факторов врожденного иммунитета. Это так же неверно, как отдельно перечислять все компоненты системы комплемента. Они действуют в содружестве, формируя единый механизм гомеостаза.

Рис. 5. Петля амплификации (усиления) в системе АПАК. С3b, продуцируемый в системе классического или альтернативного каскада, связывается (на поверхности активирующих объектов) с фактором В. Последний атакуется фактором D с отщеплением фрагмента Ва и образованием С3-конвертазы (C3bBb). Присоединение пропердина (Р) обеспечивает стабилизацию конвертазы, которая получает возможность для протеолиза новых молекул С3, амплифиируя (усиливая) первоначальную активацию комплмента. Ферментативные реакции (ограниченный протеолиз) отмечены толстыми стрелками (D.M.Weir, J.Stewart. Immunology. 8^th ed. Churchill & Livingstone. 1997).

Подобно С3-конвертазе классического пути, С3-конвертаза АПАК может функционировать и как С5-конвертаза. Это происходит после присоединения дополнительной молекулы C3b, так что С5-конвертаза получает формулу С3bBb3b. Вторая молекула С3b (она конформационно слегка отличается от первой) нужна для связывания С5 фактора и его подготовки к расщеплению Bb-протеазой. Результатом является образование двух фрагментов, С5а и С5b, которые аналогичны продуктам классического каскада. С5а-пептид остается в растворе, а С5b инициирует сборку мембраноатакующего комплекса.

Мембраноатакующий комплекс (МАК)

Результатом активации комплемента по классическому или альтернативному пути на поверхности клеток является цитолиз. Его непосредственным эффектором служит фактор С9, но он обретает активность лишь при поддержке нижестоящих факторов комплемента, С6-С9 (рис. 6). В отличие от предыдущих этапов сборка МАК происходит без протеолиза, ограничиваясь конформационными изменениями молекул терминального каскада. Сначала С5b соединяется с С6, превращая его в рецептор для С7. Это раскрывает гидрофобный участок С7, который, внедряясь в фосфолипидный слой плазматической мембраны, обеспечивает прочное закрепление С5b67 на клеточной поверхности и последовательную фиксацию факторов С8 и С9. Эффективно работающий МАК включает более десятка С9-молекул. Подвергаясь полимеризации, они пронизывают плазматическую мембрану, образуя канал, через который беспрепятственно поступает вода, вызывая лизис клетки.

Сборка МАК происходит не только на поверхности клеток, но и в жидкой фазе. Этим определяется возможность лизиса соседних клеток, напрямую не задействованных в активации комплемента. Но такого рода «реактивный цитолиз» сильно лимитирован сывороточными ингибиторами, прежде всего белком S (см. ниже).

Рис. 6. Мембраноатакующий комплекс комплемента. С5-конвертаза классического и альтерантивного путей связывает С5, расщепляя его на С5а и С5b. С5b присоединяет С6, и комплекс С5b6 отделяется от С5-конвертазы. После связывания С7 формируется гидрофобный комплекс С5b67, который фиксируется на клеточной мембране рядом с участком активации. С8 (он рецептируется фактором С5b) пронизывает мембрану, обеспечивая внедрение и полимеризацию молекул С9 (пС9) с образованием трансмембранного канала.

Дата добавления: 2014-01-14