Методы определения Mr белков

Виды электрофореза

а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в градиенте как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается градиент рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.

Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).

б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.

в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.

г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (10¹⁰–10¹² белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.

а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);

w – угловая скорость ротора (рад/с);

i – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).

Величина константы седиментации S, которая равна 1´10^–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.

Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;

Т – абсолютная температура по Кельвину;

S – константа седиментации;

Д – коэффициент диффузии;

r – плотность растворителя;

V – парциальный удельный объем газа.

Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.

Более просты и дешевы:

б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.

Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr. Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.

в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Дата добавления: 2014-11-06