Определения нуклеиновых кислот

Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного

Определения нуклеиновых кислот по А.С.Спирину

Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками и капельницами; пипетки вместимостью 2 мл; водяная баня; спектрофотометр.

Материал.

1. Гидролизат дезоксирибонуклеопротеидов ткани селезенки (полученный в работе 13, г).

2. РНК дрожжевая, свежеприготовленный раствор.

Метод основан на измерении светопоглощения нуклеиновых кислот при 270 и 290 нм, интенсивность которого пропорциональна их количеству в пробах.

Ход определения. В одну пробирку вносят 1,0 мл гидролизата ДНК, в другую – тот же объем раствора РНК и доводят дистиллированной водой до 1,5 мл.

Добавляют в каждую пробу по 1,5 мл раствора хлорной кислоты, закрывают пробирки капельницами и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 20 мин. Гидролизаты охлаждают. Определяют экстинкцию содержимого каждой пробы на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при 270 и 290 нм.

Расчет. Содержание ДНК рассчитывают по формуле

(Е₂₇₀ – Е₂₉₀) · 10,1

х₁ = ——————————,

0,19

а РНК – по формуле

(Е₂₇₀ – Е₂₉₀) · 10,5

х₂ = ——————————,

0,19

где х₁ и х₂ – концентрации ДНК и РНК, мг/л;

Е₂₇₀ – экстинкция исследуемого гидролизата при 270 нм;

Е₂₉₀ – экстинкция исследуемого гидролизата при 290 нм;

0,19 – удельная экстинкция фосфора нуклеиновых кислот в концентрации 1 мг/л;

10,1 и 10,5 – коэффициенты пересчета содержания фосфора на концентрацию нуклеиновых кислот исходя из теоретического содержания фосфора в ДНК 9,9% и в РНК 9,5%.

Примечание. Предварительно проверяют чистоту образца. Для этого измеряют экстинкцию исследуемых растворов ДНК и РНК при 260, 270 и 290 нм. Отношение Е₂₆₀/Е₂₇₀ не должно быть выше 1,2, а отношение Е₂₇₀/Е₂₉₀ – не меньше 2,0. Если эти условия не соблюдаются, то пробы содержат примеси нуклеиновой природы.

Оформление работы. По результатам измерений отметить чистоту образцов нуклеиновых кислот, рассчитать их концентрацию в исследуемых пробах. В выводе указать возможности данного метода определения содержания нуклеиновых кислот.

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор; дифениламиновый реактив^*; орциновый реактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал.

1. Гидролизат ДНК ткани селезенки (см. работу 13, г).

2. ДНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

3. РНК дрожжевая, опытный раствор.

4. РНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

а. Определение содержания ДНК (по Дише). Метод основан на образовании окрашенного комплекса дезоксирибозы с дифениламином (см. работу 13, б), интенсивность которого пропорциональна концентрации этой пентозы в гидролизатах ДНК.

Ход определения. В пробирку наливают 0,5 мл стандартного раствора ДНК и равный объем раствора хлорной кислоты. Ставят пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают содержимое.

Во вторую пробирку вносят 1 мл гидролизата ДНК ткани селезенки (опытная проба), затем прибавляют в обе пробирки по 2 мл дифениламинового реактива Дише. Пробы перемешивают стеклянной палочкой и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 10 мин для развития окраски. Затем содержимое пробирок охлаждают.

Опытную и стандартные пробы фотометрируют против контрольной пробы на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 595 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольную пробу готовят перед фотометрией. Она содержит 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл раствора хлорной кислоты, 2 мл реактива Дише. Кипятят содержимое пробирки в течение 10 мин на водяной бане. Охлаждают.

Расчет. Содержание ДНК в опытной пробе х (г/л) рассчитывают по формуле

Е_оп

х = ————,

Е_ст ,

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать концентрацию опытного образца ДНК, указать в выводе возможность использования дифениламиновой реакции для количественного определения ДНК.

б. Определение содержания РНК. Метод основан на образовании окрашенного комплекса рибозы, входящей в состав РНК, с орцином. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации РНК в растворе.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 2 мл соответственно исследуемого (опытного) и стандартного растворов РНК, приливают по 2 мл орцинового реактива и нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. Пробы охлаждают.

Фотометрию опытной и стандартной проб проводят против контрольной на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 670 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольная проба обрабатывается так же, только вместо раствора РНК используется такое же количество дистиллированной воды.

Расчет. Концентрацию РНК в опытном образце х (г/л) рассчитывают по формуле

Е_оп

х = ——————,

Е_ст

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкциям рассчитать концентрацию опытного образца РНК, указать в выводе возможность количественного определения РНК по орциновой реакции на пентозы.

Дата добавления: 2014-11-06