Биохимические исследования крови

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ

Состояние биохимических процессов в тканях и органах оценивается прямым и косвенным способом. В первом случае для этой цели берутся на исследование кусочки ткани (биоптаты), а во втором, который более приемлемым для клиники, - биологические жидкости, главным образом кровь и моча.

Кровь является жидкой тканью организма, состоящей из клеток и плазмы. Обмен веществ клеток крови частично отражает общие закономерности метаболизма, по которым можно судить о его сдвигах в других тканях. Однако форменные элементы крови выполняют также специальные функции, для оценки которых изучают соответствующие биохимические показатели. Составные компоненты плазмы (белки, небелковые органические и минеральные вещества) дают необходимую информацию о функциях собственно крови (транспортной, регуляторной и т.д.) и об изменениях метаболизма, произошедших в разных тканях.

Биохимические исследования мочи позволяют судить об изменениях не только в выделительной и мочеобразовательной функциях почек, но и об обмене веществ в других органах и организме в целом.

Работа 85. Определение содержания гемоглобина в крови

по его светопоглощению

Реактивы. Гидроксид аммония, 0,4 г/л раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1 и 10 мл; ФЭК.

Материал. Кровь, взятая из пальца обследуемого.

Метод основан на измерении при 450 нм светопоглощения содержащегося в крови гемоглобина, которое пропорционально его концентрации.

Ход определения. В пробирку отмеривают 8 мл раствора гидроксида аммония. Микропипеткой берут из пальца обследуемого 0,05 мл крови и вносят ее в пробирку. Микропипетку трижды ополаскивают этим же раствором, тщательно перемешивают содержимое, при этом происходит полный гемолиз эритроцитов и просветляется жидкость. Пробирку встряхивают 2-3 мин для полного оксигенирования гемоглобина.

Определяют экстинкцию гемолизированной крови против воды на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание гемоглобина в крови определяют по калибровочному графику, построенному по серии растворов кристаллического гемоглобина с известными концентрациями.

Оформление работы. По полученным экстинкциям определить содержание гемоглобина в крови (в г/л), сделать вывод о возможном изменении количества гемоглобина и указать вероятные его причины.

Практическое значение работы. Нормальное содержание гемоглобина у взрослого человека составляет у мужчин 130-160 г/л, у женщин 120-140 г/л. У новорожденных концентрация гемоглобина выше, чем у взрослых, а к концу первого года жизни она уменьшается до 110 г/л и вновь достигает уровня взрослого человека в период половой зрелости. Пониженное содержание гемоглобина (анемия) наблюдается при кровопотерях, недостатке железа в организме, дефиците витамина В₁₂ и фолиевой кислоты, при отравлении лекарствами и токсическими веществами, вызывающими гемолиз эритроцитов (гемолитическая анемия) и т.д. Высокое содержание гемоглобина (200 г/л и выше) имеет место при повышенном количестве эритроцитов в крови (полицитемия).

Работа 86. Определение содержания фетального гемоглобина

в эритроцитах крови человека

Реактивы. Раствор ферриацетонциангидрата^*; раствор ацетонциангидрина^*; денатурирующий раствор едкого натрия^*; осаждающий раствор сульфата аммония (3,28 моль/л)^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2 и 5,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; секундомер; обеззоленные фильтры; спектрофотометр или фотоколориметр.

Материал. Гепаринизированная кровь.

Метод основан на способности ацетонциангидрина в присутствии раствора гемоглобина образовывать цианметгемоглобин (гемоглобинцианид), интенсивность окрашивания которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе.

Ход определения. Кровь в количестве 1-2 мл, полученную при наличии гепарина, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования плазму сливают и оставшийся осадок эритроцитов отмывают 8-10 объемами изотонического раствора хлористого натрия. Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут и отсасывают супернатант. Из полученных эритроцитов готовят эритроцитарную массу путем разведения физиологическим раствором в отношении 1:1, которая и используется для получения гемолизата. С этой целью к 0,2 мл эритроцитарной взвеси добавляют 5 мл раствора ферриацетонциангидрина. В полученном гемолизате проводят определение содержания общего и фетального гемоглобина. При определении общего гемоглобина через 15 минут к 0,1 мл полученного гемолизата добавляют 5 мл раствора ацетонциангидрина. При определении фетального гемоглобина к 3,0 мл гемолизата добавляют 0,2 мл гидроксида натрия (для денатурации нормального гемоглобина) и выдерживают точно 2 минуты (по секундомеру) при температуре 22-24˚С и затем добавляют 3,2 мл раствора сульфата аммония. Пробирку встряхивают несколько раз и через 10 минут содержимое фильтруют через двойной обеззоленный фильтр диаметром 9 см.

Растворы общего и фетального гемоглобина фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 420 нм.

В качестве контроля служат: для определения общего гемоглобина – раствор ацетонциангидрина, для определения фетального гемоглобина – 0,2 мл гидроксида натрия и 3,2 мл сульфата аммония.

Расчет проводится по формуле

фетал.Нв∙(6,4/3,0)∙100

%Нв = ——————————————,

общий Нв∙51

где 6,4 – конечный объем фетального гемоглобина после денатурации гидроксидом натрия и осаждения сульфатом аммония;

3,0 – исходный объем гемолизата, содержащий общий гемоглобинцианид;

51 – фактор разбавления общего гемоглобинцианида;

100 – перевод в проценты.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать содержание фетального гемоглобина, сравнить с нормой и сделать вывод о возможных отклонениях.

Практическое значение работы. В норме содержание фетального гемоглобина в эритроцитах составляет 0,75-0,97%. Повышение фетального гемоглобина является важным критерием для диагностики бета-талассемии, при которой одновременно повышается и содержание гемоглобина А₂. Особенно высокое содержание фетального гемоглобина может быть при гомозиготной бета-талассемии до 20-90%. При гетерозиготной форме бета-талассемии содержание фетального гемоглобина может быть нормальным или умеренно повышенным – 2,57%.

Следует отметить, что увеличение содержания фетального гемоглобина однако не является специфичным для бета-талассемии. Оно встречается и при других состояниях: гемолитических анемиях, железодефицитной гипопластической анемии, лейкозах и других состояниях, сопровождающих гипоксией, что вероятно, связано с компенсаторными процессами.

Работа 87. Определение содержания гликозилированного гемоглобина

в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом

Реактивы. 40%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 1 М раствор щавелевой кислоты; 0,05 М раствор тиобарбитуровой кислоты; 0,04%-ный раствор гидроксида аммония; 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Оборудование. Центрифуга лабораторная; ФЭК (спектрофотометр); водяная баня; термостат; пробирки с плотно притертыми пробками.

Материал. Кровь забирают натощак из локтевой вены. Добавляют гепарин из расчета 5ед/1мл для предотвращения свертывания. Эритроциты отделяют от плазмы центрифугированием 3000 об/мин в течение 10 минут и трехкратно отмывают физиологическим раствором. Затем к суспензии эритроцитов добавляют дистиллированную воду и 1-2 капли хлороформа для гемолиза.

Метод основан на способности 5-гидроксиметилфурфурола, образующегося из углеводного компонента гликозилированного гемоглобина при его кислотном гидролизе, образовывать с тиобарбитуровой кислотой окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гликозилированного гемоглобина в эритроцитах.

Ход определения.

1. Определение концентрации гемоглобина в гемолизате.

В пробирку внести 8 мл раствора аммиака и добавить 0,05 мл гемолизата (микропипеткой, многократно промывая ее раствором аммиака). Встряхивать 2 минуты, после чего определить экстинкцию на ФЭКе (длина волны 540 нм, зеленый светофильтр) против раствора аммиака. Содержание гемоглобина в гемолизате в г/л определяют по калибровочному графику.

2. Определение процентного содержания гликозилированного гемоглобина.

В пробирку внести объем гемолизата, содержащего 10 мг гемоглобина, довести до 1 мл 0,9% раствором хлорида натрия, добавить 1 мл 1 М щавелевой кислоты, плотно закрыть пробкой и инкубировать в термостате при 100˚С в течение 5 часов.

Пробирку охладить, внести 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты, тщательно перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 оборотов в минуту.

В чистую пробирку отобрать 2 мл надосадочной кислоты, перемешать и инкубировать 40 минут на водяной бане при 40˚С, после чего фотометрируют при длине волны 443 нм против дистиллированной воды.

Содержание гликозилированного гемоглобина (в % от общего) определяют по калибровочному графику.

Практическое значение работы. Содержание гликозилированного гемоглобина в норме составляет от 3 до 5,5% от общего. Известно, что уровень гликозилированного гемоглобина может являться показателем уровня гликемии за предшествующие 2-3 месяца. В связи с этим определением уровня гликозилированного гемоглобина в настоящее время применяют для ранней диагностики и оценки компенсации сахарного диабета. Помимо сахарного диабета, повышение уровня гликозилированного гемоглобина может наблюдаться при кистозном фиброзе, заболеваниях, сопровождающихся укорочением жизни эритроцитов, хронической почечной недостаточности.

Работа 88. Определение концентрации гаптоглобинов

в сыворотке крови фотоколориметрическим методом

Реактивы. Гемоглобин, 5 г/л раствор; риванол, 3 г/л раствор; сульфат аммония, 10%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на осаждении риванолом образующегося комплекса гемоглобин-гаптоглобин. Избыток добавленного к сыворотке крови гемоглобина после осаждения риванолом определяется фотоколориметрически.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки, 0,2 мл раствора гемоглобина и 0,3 мл дистиллированной воды. В контрольную пробирку вносят те же вещества, только вместо раствора гемоглобина приливают 0,2 мл дистиллированной воды.

Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают взбалтыванием, через 10 мин прибавляют в них по 2 мл раствора риванола и оставляют стоять 5 мин.

Пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Прозрачную или слегка опалесцирующую надосадочную жидкость сливают в две чистые пробирки, добавляют по 0,2 мл 10%-ного раствора сульфата аммония (для просветления жидкости) и оставляют стоять при комнатной температуре 20 мин.

В стандартную пробирку помещают 2,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл раствора гемоглобина и 0,2 мл сульфата аммония.

Измеряют экстинкцию всех трех проб против воды на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формуле

[Е_ст – (Е_оп – Е_к)]2000∙0,003

х = ———————————————,

Е_ст

где х – содержание гаптоглобинов в сыворотке крови, г/л;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция контрольной пробы;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы;

2000 – пересчет на литр сыворотки;

0,003 – содержание гемоглобина в стандартной пробе, г/л.

Оформление работы. По значениям экстинкции рассчитать содержание гаптоглобинов в сыворотке крови. Сделать вывод о возможных изменениях количества гаптоглобинов.

Практическое значение работы. В сыворотке крови взрослого здорового человека концентрация гаптоглобинов составляет 0,28-1,90 г/л. Гаптоглобины входят в состав фракции α-глобулинов сыворотки крови. У новорожденных гаптоглобины, как правило, отсутствуют. Они начинают появляться в возрасте один-два месяца и достигают уровня взрослых к первому полугодию. Гаптоглобины связывают внеэритроцитарный гемоглобин, образуя с ним комплекс. Тем самым гаптоглобин выполняет в организме защитную функцию, например, при разрушении эритроцитов (гемолизе). При гемолизе гаптоглобин препятствует экскреции гемоглобина почками, предотвращая нарушение функции канальцев.

Работа 89. Проба Вельтмана в модификации Тейфеля

на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови

Реактивы. Хлорид кальция, 5 г/л раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1 и 5 мл.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на разной устойчивости отдельных белковых фракций сыворотки крови к коагуляции под действием определенных концентраций хлорида кальция и нагревания.

Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и 4,9 мл дистиллированной воды и перемешивают встряхиванием. К содержимому добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция, пробирку встряхивают и осторожно нагревают раствор над пламенем до закипания. После этого пробирку охлаждают и смотрят на свет. Равномерное помутнение жидкости, независимо от его интенсивности, не свидетельствует об окончании реакции. Она завершается только при появлении хлопьев. Если же они не образуются, то вновь приливают в ту же пробирку 0,1 мл хлорида кальция, нагревают ее до закипания жидкости и так повторяют, пока не выпадет хлопьевидный осадок.

Отмечают объем хлорида кальция, пошедший на образование хлопьевидного осадка белков, и определяют состояние коагуляционной ленты Вельтмана по схеме

№ пробы
CaCl2	1,0	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Изменения	Сдвиг влево	Норма	Сдвиг вправо
Патология	Острые воспалительные и экссудативные состояния, опухоли			Повреждения печени, фиброзы, гемолиз, хронические воспалительные заболевания

Оформление работы. Отмечают объем хлорида кальция (в мл), пошедший на образование хлопьевидного осадка. В выводах указать изменения коагуляционной ленты Вельтмана.

Практическое значение работы. Нарушение соотношения белковых фракций крови (диспротеинемия) при ряде патологических процессов приводит к нарушению коллоидной устойчивости белков. Сдвиг коагуляционной ленты вправо (на образование хлопьевидного осадка пошло менее 0,4 мл CaCl₂), обусловленный повышением содержания γ-глобулинов в сыворотке крови, наблюдается при повреждении печени (гепатит, цирроз, дистрофия), гемолизе и хронических воспалительных процессах (пневмония, туберкулез, остеомиелит, пиелонефрит, ревматизм и др.). Сдвиг коагуляционной ленты влево (на образование хлопьевидного осадка пошло более 0,5 мл CaCl₂), обусловленный увеличением содержания сывороточных α- и β-глобулинов, отмечается при острых воспалительных и экссудативных процессах (ревматизм, туберкулез), сахарном диабете, поражении почек и злокачественных опухолях.

Работа 90. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови

амилокластическим методом

Реактивы. Крахмал, 20 г/л раствор; фосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 7,2; натрия хлорид, 30 г/л раствор; соляная кислота, 1 М раствор; иод, 0,1 М раствор в 30 г/л растворе иодида калия.

Оборудование. Водяная баня; термостат, отрегулированный на 37˚С; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; мерные колбы вместимостью 50 мл; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на фотометрическом определении убыли крахмала в ходе реакции гидролиза его α-амилазой сыворотки крови. Разница концентраций крахмала до и после гидролиза пропорциональна активности фермента.

Ход определения. В две пробирки, опытную и контрольную, вносят по 0,5 мл растворов крахмала, по 0,3 мл фосфатного буфера и по 0,1 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают встряхиванием и помещают на 10 мин в водяную баню при 37˚С.

В опытную пробу добавляют 0,1 мл сыворотки крови, а в контрольную – 0,1 мл раствора соляной кислоты и затем 0,1 мл сыворотки крови. Тщательно перемешивают смесь в пробирках и ставят пробы на 30 мин в термостат при 37˚С.

По окончании инкубации в опытную пробирку прибавляют 0,1 мл раствора соляной кислоты и быстро перемешивают содержимое встряхиванием – реакция останавливается.

Отбирают по 0,2 мл содержимого обеих пробирок и переносят в две мерные колбы на 50 мл. Приливают в них по 40 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл раствора иода в иодиде калия. Перемешивают и доводят объем до метки дистиллированной воды.

Полученные растворы тотчас фотометрируют на ФЭКе против воды при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Примечание. Опытные и контрольные пробы должны иметь одинаковую температуру, так как ее изменение сказывается на интенсивности окраски иод-крахмального раствора.

Расчет проводят по формуле

(Е_к – Е_оп)0,01∙2∙1000

х = ——————————

Е_к0,1

где х – активность амилазы сыворотки крови, г/(ч∙л);

Е_к – экстинкция контрольной пробы;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

0,01 – масса крахмала в пробе, г;

2 – пересчет на 1 ч инкубации;

1000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

0,1 – объем сыворотки крови, взятой на исследование, мл.

Оформление работы. Рассчитать активность фермента, сравнить ее с нормой и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме активность амилазы сыворотки крови, определенная амилокластическим методом, составляет 15-30 г/(ч∙л). Источником сывороточной амилазы служат поджелудочная железа и слюнные железы. У здорового человека количество слюнной и панкреатической амилазы примерно одинаково. Возрастание активности амилазы крови (гиперамилаземия) наблюдается при остром панкреатите, когда она повышается в 10-30 раз, достигая максимума через 24 ч после начала заболевания, и затем постепенно приходит к норме на 2-6-й день. При хронических панкреатитах гиперамилаземия умеренная. Она встречается также при поражении слюнных желез. Гипоамилаземия отмечается при недостатке внешнесекреторной функции поджелудочной железы, заболеваниях печени (гепатит, цирроз, интоксикации), расстройствах питания (токсические диспепсии), сахарном диабете и т.д.

Работа 91. Определение содержания кальция в сыворотке крови

мурексидным методом

Реактивы. Комплексон III, 0,665 г/л раствор; гидроксид натрия, 9 М раствор; мурексид, растертый в тонкий порошок с NaCl в соотношении 1:50.

Оборудование. Конические колбочки вместимостью 50 мл; микробюретка.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности мурексида образовывать с ионами кальция в щелочной среде комплексные соединения, окрашенные в красно-фиолетовый или бледно-розовый цвет (в зависимости от концентрации). При титровании раствором более сильного комплексообразователя (комплексон III) это комплексное соединение разрушается и связанный мурексид вновь освобождается, что приводит к появлению его натуральной окраски (фиолетовой или бледно-сиреневой). Объем комплексона III, пошедший на титрование, пропорционален содержанию кальция в сыворотке крови.

Ход определения. В коническую колбочку вносят 50 мл дистиллированной воды, 0,4 мл раствора гидроксида натрия, на кончике скальпеля мурексид и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Появляется бледно-сиреневая окраска, обусловленная цветом самого индикатора.

Отбирают 25 мл полученного раствора в колбочку для титрования (оставшийся раствор служит эталоном сравнения) и добавляют 0,5 мл сыворотки крови, при этом появляется бледно-розовое окрашивание, обусловленное образованием кальциево-мурексидного комплекса.

Смесь титруют раствором комплексона III до первоначальной окраски индикатора. Конец титрования контролируют, сопоставляя окраску опытной пробы с эталоном (неиспользованная часть раствора).

Расчет. Содержание кальция рассчитывают по формуле

V72

х = ——————————,

40∙0,5

где х – содержание кальция в сыворотке крови, ммоль/л;

V – объем раствора комплексона III, пошедший на титрование, мл;

0,5 – объем сыворотки, взятый на исследование, мл;

72 – коэффициент пересчета количества кальция на 1 л сыворотки с учетом эквивалентности комплексообразователя;

40 – молекулярная масса кальция.

Оформление работы. Рассчитать содержание кальция в сыворотке крови (в ммоль/л), сравнить с нормой и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме содержание кальция в сыворотке крови составляет 2,25-2,75 ммоль/л. Гиперкальциемия наблюдается при гипервитаминозе D, гиперпаратиреоидизме, при сердечной недостаточности, желтухе. Гипокальциемия встречается при спазмофилии, рахите, хронических заболеваниях почек, гипопаратиреоидизме и т.д.

Дата добавления: 2014-11-06