Приготовление некоторых реактивов 1 страница

Приготовление буферных растворов

Специальное исследование мочи

а. Ферменты

α-амилаза

28-160 г/(ч∙л)

б. Небелковые азотсодержащие вещества

Аминокислоты (по азоту)	0,29-5,35 ммоль/сут
Мочевина	333-582,8 ммоль/сут
Мочевая кислота	2,36-5,9 ммоль/сут
Креатинин	4,4-17,6 ммоль/сут
Креатин	0-0,456 ммоль/сут
Аммиак	30-60 ммоль/сут
Дельта-аминолевулиновая кислота	3,9-19,0 мкмоль/г креатинина
Копропорфирин	30,5-122,0 нмоль/г креатинина

в. Минеральные компоненты

Калий	61-79 ммоль/сут
Натрий	174-222 ммоль/сут
Кальций	4,02-4,99 ммоль/сут
Магний	1,20-8,19 ммоль/сут

г. Гормоны, медиаторы и их метаболиты

Альдостерон	2,8-41,6 нмоль/сут
17-Оксикортикостероиды (общие)	3,61-20,38 мкмоль/сут
17-Кетостероиды:
мужчины	22,9-81,1 мкмоль/сут
женщины	17,2-62,5 мкмоль/сут
Ванилилминдальная кислота	3,53-19,2 мкмоль/сут

д. Витамины

С (аскорбиновая кислота)	113,5-170,3 мкмоль/сут
В1 (тиамин)	0,14-0,29 ммоль/сут
В2 (рибофлавин)	1,08-1,80 ммоль/сут

ЖЕЛУДОЧНЫЙ СОК

рН	1,5-3,5
Общая кислотность	40-60 ммоль/л (40-60 ед.)
Свободная соляная кислота	20-40 ммоль/л (20-40 ед.)
Связанная соляная кислота	5-20 ммоль/л (5-20 ед.)

СПИННО-МОЗГОВАЯ ЖИДКОСТЬ

Плотность	1,006-1,007
Цвет	Бесцветная
Белок	0,22-0,33 г/л
Альбумины	0,17-0,24 г/л
Глобулины	0,025-0,05 г/л
Альбумины	58,3%
Преальбумины	5,7%
α1-глобулин	5%
α2-глобулин	7%
β-глобулин	15,5%
γ-глобулин	8,5%
Глюкоза	2,50-3,89 ммоль/л
Фруктоза	0,1-0,2 ммоль/л
Хлориды	12-130 ммоль/л

НЕКОТОРЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРОБЫ

С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Проба на коллоидную устойчивость (проба Вельтмана в модификации Тейфеля)	4-5∙10^3 мл CaCl2 /л
Сулемовая проба (по Гринстедту)	3,2-4,4∙10^3 мл сулемы/л
Клеточная фильтрация	7,2 л/ч
Клирентс мочевины:
«максимальный»	3,84-5,94 л/ч
«стандартный»	2,4-3,78 л/ч

1. Фосфатно-цитратный буфер (0,1 М, рН 5,0-8,0)

Исходные растворы:

1. 0,2 М раствор Na₂HPO₄∙2H₂O (35,61 г соли растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 л).

2. 0,1 М раствор лимонной кислоты (21,01 г кислоты растворяют в дистиллированной воде в колбе вместимостью 1 л). Для получения нужного рН смешивают растворы в следующих количествах:

рН	Na2HPO4 0,2 М, мл	Лимонная кислота, 0,1 М, мл
5,6	5,8	4,2
6,4	6,9	3,1
6,8	7,7	2,3
7,2	8,7	1,3
8,0	9,7	0,3

2. Фосфатный буфер (0,1 М, рН 5,8-8,0)

Na2HPO4 0,2 М, мл	Na2H2PO4 0,2 М, мл	Вода, мл	рН
8,0	92,0	До 200	5,8
12,3	87,7	-″-	6,0
18,5	81,5	-″-	6,2
26,5	73,5	-″-	6,4
37,5	62,5	-″-	6,6
49,0	51,0	-″-	6,8
61,0	39,0	-″-	7,0
72,0	28,0	-″-	7,2
81,0	19,0	-″-	7,4
87,0	13,0	-″-	7,6
91,5	8,5	-″-	7,8
94,7	5,3	-″-	8,0

3. Трис-буфер (0,1 М, рН 7,1-9,2)

24,2 г трис-(гидроксиметил) аминометана растворяют в мерной колбе вместимостью 1 л (в 500 мл Н₂О). Для получения необходимого значения рН прибавляют указанный в таблице объем 1 М HCl и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл.

рН	HCl, мл	рН	HCl, мл
7,1		8,3
7,2		8,5
7,4		8,7	16,5
7,8		9,2	5,75
8,1

4. Ацетатный буфер (0,2 М, рН 3,6-5,8)

Ацетат натрия 0,2 М, мл	Уксусная кислота 0,2 М, мл	рН	Ацетат натрия 0,2 М, мл	Уксусная кислота 0,2 М, мл	рН
0,75	9,25	3,6	5,90	4,10	4,8
1,20	8,80	3,8	7,00	3,00	5,0
1,80	8,20	4,0	7,90	2,10	5,2
2,65	7,35	4,2	8,60	1,40	5,4
3,70	6,30	4,4	9,10	0,90	5,6
4,90	5,10	4,6	9,40	0,60	5,8

5. Глициновый буфер (0,05 М, рН 8,6-10,6)

Смешивают указанные объемы глицина и гидроксида натрия и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл

рН	Глицин 0,2 М, мл	NaOH 0,2 М, мл	рН	Глицин 0,2 М, мл	NaOH 0,2 М, мл
8,6		4,0	9,6		22,4
8,8		6,0	9,8		27,2
9,0		8,8	10,0		32,0
9,2		12,0	10,4		38,6
9,4		16,8	10,6		45,5

Активирующий раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 155 мг восстановленного глутатиона и 400 мг кристаллического альбумина, растворяют их в 50 мл дистиллированной воды и с помощью 1 М раствора NaOH доводят рН до 8,2. Затем доливают до метки воду.

Аммиачный раствор нитрата серебра. К 2-3%-ному раствору серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка.

Ацетатный буферный раствор рН 3,6. Готовят смешивая 463 мл раствора А и 37 мл раствора Б, доводят до метки водой в мерной колбе до 1 л. Раствор А: 11,55 мл ледяной уксусной кислоты разводят водой в мерной колбе на 1 л. Раствор Б: 27,2 г ацетата натрия растворяют в воде в колбе на 1 л.

Биуретовый реактив (реактив Бенедикта). 173 г цитрата натрия и 100 г карбоната натрия растворяют в 300 мл дистиллированной воды на водяной бане. Отдельно в 300 мл воды растворяют 17,3 г сульфата меди. Оба раствора сливают и доводят общий объем до 1 л.

Буферный раствор. 2,76 г веронала и 2,06 г мединала растворяют в 1 л дистиллированной воды. Хранят в холодильнике, при появлении осадка раствор не пригоден к употреблению.

Взвесь угля. 0,25 г активированного угля помещают в мерную колбу на 100 мл и разбавляют ацетатным буфером рН 3,6. Перед употреблением тщательно встряхивать.

Восстанавливающий реактив. 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты, приготовленный на 0,016%-ном растворе сульфата меди.

Гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере (рН 4,0). Сначала готовят 8%-ный раствор гемоглобина на 8 моль/л растворе мочевины, выдерживают его 2 ч в термостате при 60˚С и перед употреблением разводят ацетатным буфером в 2 раза.

Глицил-глицин. 0,55 ммоль/л, рН – 8,3. 3,63 г глицил-глицина помещают в мерную колбу на 50 мл, доливают водой до метки (буферный раствор).

Денатурирующий раствор. Растворить 1 ампулу ацетонциангидрина (0,5 мл – 0,47 г из набора по определению гемоглобина в крови) в 1 л дистиллированной воды.

Диазореактив для определения билирубина. Готовят два раствора. Первый раствор: 3 г сульфаниловой кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (на горячей бане), доводят объем водой до 1 л. Второй раствор: 0,5%-ный водный раствор нитрита натрия. Перед употреблением смешивают 5 мл первого раствора и 0,25 мл второго.

Диацетил, рабочий раствор. 1 мл диацетила разводят дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл (раствор хранят в холодильнике). Рабочий раствор диацетила готовят перед употреблением, добавляя в 1 мл основного раствора диацетила 24 мл дистиллированной воды.

Дифениламиновый реактив. 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору прибавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты.

Калибровочный раствор. Основной – 0,75 ммоль/л АЛК (100 мкг/мл) в пересчете на основание: 0,00635 г АЛК гидрохлорида растворяют в ацетатном буфере рН 3,6 в мерной колбе на 50 мл. Хранят в холодильнике не более месяца. Из основного готовится рабочий калибровочный раствор, 1 мкг/мл. Готовят перед употреблением разведением основного раствора ацетатным буфером в 100 раз.

Калибровочный раствор. 22,5 мг диоксиацетона при нагревании растворяют в 25 мл воды. 1 мл такого раствора содержит 10 мкмолей диоксиацетона. В ряд пробирок (см. работу) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают до нужного объема и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента.

Калибровочный (стандартный) раствор железа (30 мкмоль/л).

Сначала готовят соли Мора.

содержащий 3 ммоль/л, растворяя 1,178 г в 5 мл 0,3 н. соляной кислоты, после чего доводят до 1 л водой (подкисленной 1 мл концентрированной серной кислоты). Рабочий стандартный раствор железа получают из основного путем разведения подкисленной водой в 100 раз. Полученный раствор содержит 30 мкмоль/л или 1,67 мкг/мл железа.

Кофеиновый реактив. 1 г чистого кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50-60˚С, перемешивают, охлаждают и доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Молибдат аммония в азотной кислоте. 7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и прибавляют 100 мл 32%-ной азотной кислоты.

Моча при алкаптонурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют гидрохинон из расчета 20 г/л.

Моча при гипераминоацидурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют глицин из расчета 1,0 г/л.

Моча при мукополисахаридозе. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют хонсурид или гепарин из расчета 0,05-0,1 г/л.

Моча при пентозурии. При отсутствии патологической в мочу добавляют ксилулозу или рибозу из расчета 1,0 г/л.

Моча при тирозинозе. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют тирозин из расчета 0,4-0,5 г/л.

Моча при фруктозурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют фруктозу из расчета 0,3-0,4 г/л.

Моча при цистинурии. При отсутствии патологической в нормальную мочу добавляют цистин из расчета 0,4-0,5 г/л.

Натрия ацетат 3-водный, насыщенный раствор. 375 г ацетата натрия 3-водного (или 226 г безводной соли) растворяют в 250 мл теплой воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при комнатной температуре. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

Натрий фосфат двузамещенный 0,25 моль/л. Готовят, растворяя 9,7 г Na₂HPO₄∙12H₂O или 18 г Na₂HPO₄∙12H₂O в воде в колбе на 200 мл. При добавлении 2 мл этого раствора к 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты рН должен быть в пределах 5,0-6,0.

Основной калибровочный раствор креатинина, 10 ммоль/л. 113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором соляной кислоты. При построении калибровочного графика из основного раствора готовят рабочий раствор путем разведения основного раствора водой в 100 раз, 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль креатинина. Исходя из этого получают ряд пробирок с соответствующими концентрациями креатина.

Окислительная смесь для определения тиамина. К 8 мл 1%-ного гексацианоферрата (III) калия приливают 20 мл 30%-ного раствора NaOH, тщательно перемешивают. Готовят перед употреблением.

Орциновый реактив. К 1 г орцина прилить 500 мл 30%-ной соляной кислоты (плотностью 1,15 г/см³). Перемешать до растворения и добавить 4-5 мл 10%-ного раствора хлорида железа (III) FeCl₃. Реактив хранят в плотно закупоренной темной склянке.

Основной калибровочный раствор п-нитроанилина. 0,0829 г п-нитро­анилина помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водой и растворяют.

Осаждающий раствор. Растворить 561 г сульфата аммония в 1 л дистиллированной воды и через сутки профильтровать.

Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4. Растворяют 33,5 г NaOH в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и добавляют 226,8 г KH₂PO₄, встряхивают до полного растворения, охлаждают и доливают водой до метки. Для приготовления рабочих растворов основного фосфатного буфера в мерные колбы вместимостью 100 мл отмеривают следующие объемы основного фосфатного буфера (в мл): № 1 – 92,51; № 2 – 74,91; № 3 – 59,18 и № 4 – 48,68, после чего доводят их содержимое водой до метки.

Пикриновая кислота, насыщенный раствор. Товарная пикриновая кислота содержит 15-20% влажности, кислоту не сушить. Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют 2 г пикриновой кислоты при нагревании в горячей бане. После этого раствор оставляют стоять на 24 часа, периодически перемешивая. Затем раствор фильтруют. Раствор стабилен и хранится в посуде из темного стекла.

Пирофосфатный буфер 0,05 М с рН 8,2. Переносят 4,46 г пирофосфата натрия в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют его примерно в 100 мл воды, доводят рН с помощью 0,1 М раствора HCl до 8,2 и доливают дистиллированной водой до метки.

Пирофосфатный буфер 0,1 М с рН 8,5. Переносят 4,46 г пирофосфата натрия в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют его в 50 мл воды, доводят рН с помощью 0,1 М раствора HCl до 8,5 и доливают дистиллированной водой до метки.

Рабочий реактив. Готовят в день определения, смешивая 30 частей 0,3 н гидроксида натрия. 2 части 0,5% раствора фенолфталеина и 1 часть 0,12% раствора сульфата меди.

Раствор ацетонциангидрина. Растворить 1 ампулу ацетонциангидрина (0,5 мл – 0,47 г из набора по определению гемоглобина в крови) в 1 л дистиллированной воды.

Раствор ферриацетонциангидрина. Растворить в 1 л дистиллированной воды 200 мг железосинеродистого калия и 1 ампулу (0,5 мл – 0,47 г) ацетонциангидрина: возможно использование из набора реактивов для приготовления трансформирующего раствора по определению гемоглобина крови. Устойчив в течение нескольких месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

Раствор глюоксидазы. Содержит около 300 ед. в 1 мг. Готовят, растворяя соответствующее количество сухого препарата в 10 мл воды.

Раствор сульфонированного бато-фенантролина. В пробирке к 100 мг бато-фенантролина приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл бидистиллированной воды, вновь нагревают на водяной бане в течение 5 мин. Смесь переносят в колбу на 200 мл, добавляют 100 мл воды, рН раствора доводят до 4-5 н NaOH и добавляют водой до объема 200 мл.

Раствор иода в иодиде калия (раствор Люголя). В 100 мл дистиллированной воды растворяют 20 г иодида калия и 10 г иода. Перед употреблением раствор разводят в 5 раз.

Раствор п-нитрозодиметиланилина (НДМА). Имеющийся в продаже препарат НДМА перекристаллизовывают из этилового эфира. Для измерения алкогольдегидрогеназы 1 мг НДМА растворяют в 100 мл 0,1 М пирофосфатного буфера (рН 8,5). Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр и разводят фильтрат в 2 раза тем буфером. Хранят при 4˚С в течение двух месяцев.

Реактив Илька. К 5 частям (по объему) уксусного ангидрида добавляют 1 часть ледяной уксусной кислоты, затем постепенно вливают 1 часть концентрированной серной кислоты. Хранить реактив на холоду!

Реактив Миллона. (Готовят под тягой!) В 57 мл концентрированной азотной кислоты растворяют 40 г ртути сначала на холоду, а затем нагревая на водяной бане. Полученный раствор разбавляют 2 объемами воды, дают отстояться и сливают с осадка. Хранят во флаконе из темного стекла.

Реактив молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 60 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор вносят в колбу вместимостью 100 мл. В другой колбе к 25 мл дистиллированной воды приливают 7,5 мл концентрированной серной кислоты. Второй раствор приливают к первому, охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор пригоден в течение месяца.

Реактив «НАДИ». 1%-ный раствор диметил-п-фенилендиамина смешивают с равным объемом 1%-ного раствора α-нафтола в спирте и 1,5%-ного раствора карбоната натрия. Раствор окрашен в темно-коричневый цвет и не должен иметь розового оттенка. Готовят за 1 ч до занятия.

Реактив Наша. В колбу вместимостью 100 мл вносят 15,4 г ацетата аммония, 0,3 г ледяной уксусной кислоты и 0,2 г ацетилацетона, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки.

Реактив Несслера. В мерной колбе вместимостью 500 мл смешивают 150 г иодида калия, 110 г иода, 100 мл дистиллированной воды и около 140-150 г металлической ртути и сильно встряхивают в течение 15 мин. При этом раствор самопроизвольно разогревается, и окраска, обусловленная растворенным иодом, постепенно бледнеет. Затем смесь начинают охлаждать под струей воды до сохранения отчетливой красной окраски, после чего содержимое встряхивают до перехода красной окраски в зеленоватую. После декантации осадок ртути тщательно промывают водой. Объединяют раствор и промывные воды, разбавляют их водой до 2 л. Отбирают 75 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 0,5 л, содержащую 75 мл воды и 350 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и доводят водой до метки.

Реактив Фелинга. Готовят отдельно два раствора. Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1 л растворяют 200 г сегнетовой соли и 150 г NaOH и доводят водой до метки. Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1 л растворяют в воде 40 г сульфата меди (II) и доводят водой до метки. Перед употреблением смешивают равные объемы этих растворов.

Реактив Фолина. В колбе вместимостью 1 л растворяют 1 г вольфрамата натрия и 20 г фосфорномолибденовой кислоты в 750 мл воды. Закрывают колбу пробкой с обратным холодильником и, включив ток воды в холодильнике, содержимое кипятят 10 ч; затем его охлаждают, переливают в мерную колбу и доводят водный объем реактива до 1 л.

Реактив Эрлиха. 0,7 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной соляной кислоты, приливают к 100 мл воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

Реактив Эрлиха. 1 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в мерной колбе на 50 мл в 35 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 8 мл 57%-ной хлорной кислоты и доводят до метки ледяной уксусной кислотой. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике не более недели.

Спиртовой раствор тимола (10%). 10 г очищенного тимола растворяют в 100 мл 96˚ этилового спирта. Получение очищенного тимола проводят следующим образом. 100 г тимола растворяют в 100 мл 96˚ этилового спирта, фильтруют. К фильтрату добавляют 1 л холодной дистиллированной воды, сильно встряхивают и оставляют стоять на 20 мин. Фильтруют и кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают два раза холодной дистиллированной водой. Сушат вначале на фильтровальной бумаге, потом в течение 2-3 дней в эксикаторе над безводным хлористым кальцием до постоянного веса.

Стандартный раствор. Приготовление стандартного раствора проводится смешением двух растворов: 1) 0,0962 н раствор хлористого бария: 1,175 г кристаллического BaCl₂∙2H₂O растворяют в 100 мл воды в мерной колбе. 2) 0,2 н раствор серной кислоты. Далее получают суспензию сульфата бария: 3 мл 0,0962 н раствора хлористого бария вливают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем 0,2 н раствором серной кислоты при температуре +10˚С (при этой температуре размеры частиц преципитированного сульфата бария дают относительно стабильный результат).

Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды и добавляют 0,028 г L-глутамил-п-нитроанилина и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая перемешивать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 сек. Затем раствор охлаждают до 37˚С и добавляют 2,5 мл буферного раствора. Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37˚С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторять не более двух раз.

Субстратный раствор для определения АлАТ (раствор № 1). Навески 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г аланина (0,89 г α-аланина) взвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 М растворе гидроксида натрия до полного растворения осадка (рН 7,4). Раствор переливают в колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,4). Добавляют 1 каплю хлороформа. Раствор хранят в холодильнике в замороженном состоянии.

Субстратный раствор для определения АсАТ (раствор № 2). Навески 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г α-аспарагиновой кислоты (1,33 г α-аспарагиновой кислоты) взвешивают на аналитических весах. Далее раствор готовят так же, как раствор № 1.

Субстратный раствор для определения глюкозофосфатизомеразы. Готовят мединалово-ацетатный буферный раствор с рН 7,4 (9,714 г ацетата натрия и 14,714 г мединала растворяют в воде и доводят объем до 500 мл). Смешивают 8,33 мл 0,03 М раствора двунатриевой соли глюкозо-6-фосфата с 25 мл мединалово-ацетатного буфера; добавляют к смеси 25 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и доводят водой до 100 мл. Хранят на холоду.

Субстратный раствор для определения лактатдегидрогеназы. Смешивают по 1 мл 1 М раствора лактата натрия, 9 М раствора NаCl, 0,05 M Cl₂, раствора НАД концентрации 10 г/л. Добавляют к содержимому по 2,5 мл 0,5 М раствора фосфатного буфера (рН 7,4) и 1 г/л раствора нитротетразолиевого синего. Перед употреблением к смеси прибавляют 0,25 мл раствора фенанзинметасульфата концентрации 1 г/л.

Субстратный раствор для определения фруктозобисфосфатальдолазы. 270 мг бариевой соли фруктозобисфосфата растворяют в 3,5 мл 1 М раствора соляной кислоты. Добавляют 1 мл 14%-ного раствора сульфата натрия, а выпавший при этом осадок удаляют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 1 каплю сульфата натрия. Появление мути свидетельствует о недостаточно полном осаждении ионов бария. В этом случае добавляют еще сульфата натрия и вновь центрифугируют. Центрифугат доводят 3%-ным раствором гидроксида натрия до рН 7,4-7,6, переносят в колбу вместимостью 25 мл и объем доводят до метки. Полученный раствор смешивают с 25 мл 0,56 М раствора гидразинхлорида, 25 мл 0,002 М раствора моноиодуксусной кислоты, 100 мл 0,5%-ного раствора карбоната натрия и 25 мл дистиллированной воды. Хранят в холодильнике.

Тимолово-вероналовый буфер. В мерной колбе на 100 мл смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 10%-ного спиртового раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором до метки. Величина рН должна составить 7,55.

о-Толуидиновый реактив. 0,15 г тиомочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл перегнанного О-толуидина. Хранят в темной склянке.

Фенол, насыщенный водой. В 100 г перегнанного фенола добавляют 35 мл воды и перемешивают, слегка подогревая смесь для ускорения растворения фенола.

Фенолфталин, рабочий раствор. Готовят, растворяя 75 мг вещества в 15 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия, раствор должен быть бесцветным или слегка розоватым, окрашенные растворы для работы не пригодны. Для увеличения стойкости реактива к нему добавляют 3 мг трилона, который, связывая соли тяжелый металлов, препятствует самоокислению фенолфталеина кислородом воздуха.

Фибрин. Фибрин бычьей крови отмывают от кровяных пигментов в проточной воде в течение нескольких дней до получения белого сгустка. Воду отжимают, а фибрин, залитый глицерином, хранят в плотно укупоренной банке. Перед употреблением фибрин отмывают от глицерина.

Фосфорно-ванилиновый реактив. 4 части (по объему) концентрированной ортофосфорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного водного раствора ванилина. Реактив хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

Фруктозо-1,6-бисфосфат, натриевая соль. 2,0 мл 10%-ного раствора натриевой соли фруктозо-1,6-бисфосфата разводят в колбе на 25 мл водой до метки. Стабилен при условии хранения в холодильнике.

Цветной реактив на мочевину. Таблетку из набора для определения мочевины, содержащую диацетилмонооксим и тиосемикарбазид, растворяют при нагревании в колбе на 50 мл. Раствор устойчив в течение трех недель. Перед употреблением смешивают равные объемы приготовленного раствора и 9,6%-ного раствора серной кислоты.

Щелочной раствор β-глицерофосфата. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 г β-глицерофосфата натрия и 0,85 г мединала, приливают около 30 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят водой объем до метки. В другую мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 50 мл приготовленного раствора β-глицерофосфата, 2,8 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и доводят дистиллированной водой до метки (рН раствора 8,6). Наслаивают на жидкость около 3 мл толуола. Хранят раствор в холодильнике не более 10 дней.

ОГЛАВЛЕНИЕ

	Стр.
ПРЕДИСЛОВИЕ………………………………………………..
ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ………...
1. Материал и его подготовка для биохимических исследований…………………………………………………………
2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимических исследованиях…………………………….
3. Основные приборы, используемые в практикуме………..
Фотометрические приборы………………………………..
Флуориметрические приборы……………………………..
Центрифуги…………………………………………………
Приборы для электрофореза……………………………….
4. Применение единиц СИ для выражения результатов клинико-биохимических исследований…………………...
Общие положения…………………………………………...
Некоторые рекомендации по применению единиц СИ в клинико-биохимических исследованиях…………………...
БЕЛКИ…………………………………………………………..
1. Химическая природа простых белков……………………..
Работа 1.	Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот………...
Работа 2.	Качественный анализ некоторых белковых препаратов………………………………………..
Работа 3.	Хроматографический метод разделения аминокислот……………………………………………..
2. Исследование физико-химических свойств белков………
Работа 4.	Диализ белков……………………………………
Работа 5.	Определение изоэлектрической точки белка…..
Работа 6.	Исследование денатурации белков……………..
Работа 7.	Исследование высаливания белков (на примере белков сыворотки крови)………………………..
3. Количественный анализ белков……………………………
Работа 8.	Количественное определение белка в сыворотке крови…………………………………………...
4. Состав и свойства сложных белков………………………..
Работа 9.	Химическая природа гемпротеидов…………….
Работа 10.	Выявление углеводного компонента гликопротеидов……………………………………………..
Работа 11.	Качественные реакции на фосфопротеиды (на примере казеина молока)………………………..
Работа 12.	Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса………………………………………………
Работа 13.	Химическая природа нуклеопротеидов………...
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ…………………………………
1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот……………………………………………………….….
Работа 14.	Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот……………………………………..
2. Количественные методы определения нуклеиновых кислот…………………………………………………………...
Работа 15.	Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по А.С.Спирину……………………………………...
Работа 16.	Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот………...
ЛИПИДЫ………………………………………………………..
Работа 17.	Исследование фосфолипидов…………………...
Работа 18.	Качественные реакции на стероиды……………
ФЕРМЕНТЫ…………………………………………………….
1. Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов………………………………………………..
Работа 19.	Сравнение действия α-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала…
2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам…
Работа 20.	Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале…………………………………………
Работа 21.	Обнаружение холинэстеразы (ацетилхолин ацилгидролаза; КФ 3.1.1.7) в сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа……
Работа 22.	Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу В.И.Товарницкого и Е.Н.Волуйской……...
Работа 23.	Определение глюкозофосфат-изомеразы (D-глюкозо-6-фосфат кетол-изомераза; КФ 5.3.1.9) в сыворотке крови……………………………….
3. Изучение кинетических свойств ферментов………………
Работа 24.	Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны………………………………...
4. Специфичность действия ферментов……………………...
Работа 25.	Демонстрация абсолютной субстратной специфичности уреазы (карбамидамидогидролаза; КФ 3.5.1.5)……………………………………….
Работа 26.	Специфичность действия амилазы (α-1,4-глюкан-4-глюкангидролаза; КФ 3.2.1.1) и сахаразы (β-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза; КФ 3.1.1.26)………………………………………
5. Модификаторы активности ферментов……………………
Работа 27.	Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны…
Работа 28.	Действие конкурентных ингибиторов на сукцинатдегидрогеназу (сукцинат: акцептор оксиредуктаза; КФ 1.3.99.1) мышечной ткани……...
Работа 29.	Неконкурентное ингибирование каталазы крови………………………………………………….
6. Количественное определение активности ферментов……
Работа 30.	Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу…….
Работа 31.	Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку…………………….
Работа 32.	Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому……………...
7. Исследование изоферментов……………………………….
Работа 33.	Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано……
Работа 34.	Определение активности γ-глутамил­транс-феразы в сыворотке крови………………...
БИОХИМИЯ ПИЩЕВАРЕНИЯ………………………………
Работа 35.	Исследование кислотных компонентов желудочного сока……………………………………...
Работа 36.	Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»……….
Работа 37.	Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта……………………………………………..
Работа 38.	Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы………………………………………………….
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН (БИОЭНЕРГЕТИКА)………..
1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях……………………………………………….
Работа 39.	Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани………………………………………………
Работа 40.	Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей…………………………………………………
Работа 41.	Выявление гликолиза в мышечной ткани……...
Работа 42.	Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии…………
Работа 43.	Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу…...
2. Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов……………………………………….
Работа 44.	Качественные реакции на пигменты растений………………………………………………...
Работа 45.	Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу А.Н.Бояркина…..
ОБМЕН УГЛЕВОДОВ…………………………………………
Работа 46.	Определение содержания глюкозы в крови о-толуидиновым методом …………………………
Работа 47.	Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооскидазным методом……
Работа 48.	Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону………………..
Работа 49.	Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену……….
ОБМЕН ЛИПИДОВ…………………………………………….
Работа 50.	Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом………………………...
Работа 51.	Определение содержания β- и пре-β-липопро­теидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай………………..
Работа 52.	Определение содержания холестерина в сыво­ротке крови по методу Илька…………………...
Работа 53.	Определения содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови…………………………...
Работа 54.	Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии…………………..
ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ………………………
Работа 55.	Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом………………………………………………...
Работа 56.	Определение активности катепсинов в сыворотке крови по А.А.Покровскому, А.И.Арча-кову и О.Н.Любимцевой………………………...
Работа 57.	Определение активности аспартат- и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю……………………………….
Работа 58.	Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации В.А.Буробина…………………………………….
Работа 59.	Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации П.Н.Шараева………………………...
ОБМЕН АЗОТСОДЕРЖАЩИХ НЕБЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
1. Исследование общих продуктов азотистого обмена……..
Работа 60.	Количественное определение остаточного азота в крови фотоколориметрическим методом….
Работа 61.	Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче…………………………….
Работа 62.	Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна………………………..
2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов…..
Работа 63.	Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в сыворотке крови по А.А.Покровскому, А.И.Арчакову и О.Н.Лю-бимцевой………………………………………….
Работа 64.	Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта………………………………………………
3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена……
Работа 65.	Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу……………………………………………...
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПАТОЛОГИЯ…………………………….
1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена………………………………………………………….….
Работа 66.	Выявление гипераминоацидурии……………….
Работа 67.	Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии………………………………………………...
Работа 68.	Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин и 4-гидроксифенилпировиноградную кислоту……………………………………………
Работа 69.	Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту………………………………
Работа 70.	Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче…………………….
2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена…..
Работа 71.	Выявление пентозурии пробой Биаля…………..
Работа 72.	Выявление фруктозурии пробой Селиванова….
Работа 73.	Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды…….
Работа 74.	Определение содержания порфириногена в моче……………………………………………….
Работа 75.	Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче……
Работа 76.	Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона………………………….
РЕГУЛЯТОРЫ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ………………………...
1. Исследование витаминов…………………………………...
Работа 77.	Качественные реакции на витамины…………...
Работа 78.	Определение содержания тиамина и рибофлавина флуориметрическим методом в поливитаминных препаратах………………………………
Работа 79.	Количественное определение аскорбиновой кислоты в лекарственных растениях…………...
2. Исследование гормонов, медиаторов и их метаболитов…
Работа 80.	Качественные реакции на белково-пептидные гормоны…………………………………………..
Работа 81.	Качественные реакции на гормоны – производные аминокислот…………………………………
Работа 82.	Качественные реакции на стероидные гормоны и их метаболиты………………………………….
Работа 83.	Регуляция инсулином и адреналином уровня глюкозы в крови животных……………………..
Работа 84.	Количественное определение гистамина в крови с диазотированным п-нитроанилином по Н.В.Климкиной и С.И.Плитману……………….
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ……
1. Биохимическое исследование крови………………………
Работа 85.	Определение содержания гемоглобина в крови по его светопоглощению………………………...
Работа 86.	Определение содержания фетального гемоглобина в эритроцитах крови человека…………….
Работа 87.	Определение содержания гликозилированного гемоглобина в эритроцитах крови фотоколориметрическим методом…………………………...
Работа 88.	Определение концентрации гаптоглобинов в сыворотке крови фотоколориметрическим методом…………………………………………….…..
Работа 89.	Проба Вельтмана в модификации Тейфеля на коллоидную устойчивость белков сыворотки крови……………………………………………...
Работа 90.	Определение активности α-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом…………
Работа 91.	Определение содержания кальция в сыворотке крови мурексидным методом…………………...
Работа 92.	Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер…………
Работа 93.	Сулемово-осадочная реакция (сулемовая проба по Гринседту)…………………………………….
Работа 94.	Количественное определение содержания железа в сыворотке крови…………………………..
2. Биохимическое исследование мочи………………………..
Работа 95.	Исследование физико-химических свойств мочи……………………………………………….
Работа 96.	Определение кетоновых тел и глюкозы в моче…………………………………………………..
Работа 97.	Определение белка в моче по методу Брандерберга-Робертса-Стольникова……………………
Работа 98.	Качественное определение индикана в моче…..
Работа 99.	Обнаружение некоторых пигментов в моче……
МЕТАБОЛИЗМ КСЕНОБИОТИКОВ………………………...
1. Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков…………………………………………………..
Работа 100	Выявление дыхательной активности микросом………………………………………………...
Работа 101	Исследование окислительного N-деметилиро­вания в микросомах печени по Нашу…………..
Работа 102	Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете………………...
Работа 103	Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по Т.А.Попову и О.Д.Леоненко…………………….
Работа 104	Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. с дополнениями И.В.Бокия, М.С.Усатенко и В.Ф.Трюфанова…………………………………..
Работа 105	Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по А.М.Тимофеевой в модификации Г.А.Понома-рева………………………………………………..
Работа 106	Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК) в организме…………………………………………
2. Исследование пероксидного окисления липидов биологических мембран…………………………………………...
Работа 107	Определение чувствительности эритроцитов к пероксидному гемолизу…………………………
Работа 108	Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах…………………...
ПРИЛОЖЕНИЕ………………………………………………...
1. Некоторые биохимические показатели жидких сред организма……………………………………………………….
2. Приготовление буферных растворов………………………
3. Приготовление некоторых реактивов……………………...

[1] Здесь и далее звездочкой отмечены реактивы, приготовление которых описано в приложении.

[2] Если нет в наличии продажного препарата лактатдегидрогеназы, то кристал. суспензию фермента можно получить из скелетных мышц кролика (см. Г.А.Кочетов. Пр.рук.по энзимологии.М.,Высш.шк.,1980, с.71).

[3] Методика модифицирована В.И.Глобиным.

Дата добавления: 2014-11-06