Методы выделения клеточных компонентов

Методы дезинтеграции микробов

1. Разрушение микробных клеток в механическом дезинтеграторе. В специальные нейлоновые стаканы помещают взвесь клеток (1 млрд/мл), на каждый миллилитр которой добавляют 1 г бус диаметром 0.15 мм, изготовленных из пирекс-стекла. Стакан вращается приводом электродвигателя со скоростью 3000 об/мин. Разрушение клеточных стенок бактерий наступает через 10—20 мин. Разница в экспозиции зависит от вида бактерий.

2. Разрушение клеток в прессах высокого давления. Продавливают замороженную при 30-70°С микробную массу через узкую щель под давлением в 2000 атм. При переходе бактерий из зоны высокого давления пресс-аппарата в зону атмосферного давления их клеточная стенка разрушается. Процедуру повторяют 3—4 раза. Метод является более щадящим, чем встряхивание с бусами.

3. Ультразвуковой метод дезинтеграции. Применяют генераторы, излучающие волны частотой не более 10—20 кГц и мощностью 60—100 вт. Экспозиция озвучивания зависит от вида и формы микробной клетки и колеблется от 10 до 60 минут.

4. Разрушить бактериальную клетку можно и детергентами (лаурилсульфат натрия, дезоксихолат натрия). На 1 мл взвеси бактерий добавляют 1—1,5% детергента. Экспозиция зависит от вида бактерий и подбирается опытным путем.

После дезинтеграции бактериальных клеток одним из методов из взвеси выделяют жгутики, капсульное вещество, клеточные стенки, мембраны, цитоплазматические компоненты.

1. Схема выделения жгутиков: целые микробные клетки со жгутиками – встряхивание с бусами в течение 5 мин – центрифугирование при 8000/30 мин. –осадок (целые клетки) удаляют— в надосадочной жидкости находятся жгутики (жгутиковые антигены).

2. Схема выделения капсульной фракции: целые микробные клетки с капсулами – добавляют дистиллированную воду – центрифугируют при 5000/15 мин – осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и встряхивают без бус при 3000 колебаний/мин 15 мин – центрифугируют при 10000 об/мни 20 мин – осадок удаляют – в надосадочной жидкости находится капсульная фракция.

3. Схема выделения клеточных стенок: целые микробы – встряхивание с бусами 15 мин – центрифугирование при 5000 об/мин 20 мин – осадок удаляют (неразрушенные клетки) – в надосадочной жидкости находится фракция стенок бактерий.

4. Извлечение соматических антигенов из микробных клеток осуществляется также различным химическими способами: экстрагированием трихлоруксусной кислотой, кислотным гидролизом или ферментативным перевариванием бактерий с последующим осаждением антигена спиртом или сернокислым аммонием и очисткой диализом.

5. Схема получения экзотоксинов: культивирование токсин-продуцирующих бактерий в жидкой питательной среде до максимума продукции токсина – фильтрация для удаления бактериальных тел – перевод токсина в анатоксин путем длительного воздействия на него формалина при температуре 30-40° С.

Выделенные фракции (субфракции) антигенов из тех или других анатомических структур бактериальных клеток используют для получения специфических сывороток, а они, в свою очередь, применяются для сероидентификации и серотипирования культур, выделенных, от больных или из объектов внешней среды. Многие макромолекулярные соединения микробных клеток являются антигенами, но только часть из них называют иммуногенами, т. е. способными вызвать образование антител — антитоксинов или сенсибилизированных лимфоцитов, принимающих участие в создании иммунитета. Поверхностные структуры бактерий (жгутики, капсула и клеточные стенки) значительно более антигенны, чем внутриклеточные компоненты (цитоплазма, в частности, рибосомы, ДНК). Иммуногенные фракции находятся у большинства бактерий в капсуле (микрокапсуле) и клеточной стенке. Оказалось, что изолированные физическими способами клеточные структуры более иммуногенны, чем извлеченные химическими методами комплексы. В процессе химической экстракции более значительно повреждается исходная молекулярная организация биополимера, нарушается его нативная структура, в результате чего изменяются антигенные, в том числе иммуногенные свойства извлеченного комплекса. Внутриклеточные компоненты (цитоплазма, цитомембраны, генофор), где локализованы неспецифические антигены, обладают очень низкой иммуногенностью.

Помимо получения антигенов из отдельных анатомических структур часто возникает необходимость использования бактерий, как комплекса антигенов. Схема получения корпускулярного бактериального антигена: посев бактерий на плотную оптимальную питательную среду и культивирование в течение суток — смыв культуры физиологическим раствором — прогревание взвеси бактерии при температуре 60° С (для неспоровых бактерий) в течение 1 часа — стандартизация взвеси по стандартам мутности Государственного института стандартизации и контроля (ГИСК) медицинских биологических препаратов. Стандартизацию проводят оптическим методом, т. е. путем сравнения степени мутности взвеси бактерий с готовыми стандартами. Стандарты выпускаются густотой 500 млн., 1—1,5—2 млрд. микробных тел в 1 мл. Для определения густоты полученной взвеси 1 мл ее наливают в пустую пробирку, равную по диаметру со стандартом. Мерной пипеткой доливают физиологический раствор до тех пор, пока не исчезнет разница между густотой взвеси в этой пробирке и в стандарте на 1 млрд. Густота исходной взвеси бактерий выражается в млрд/мл и равна общему объему жидкости в рабочей пробирке. Исходную взвесь разводят до нужной концентрации бактерий. Определение количества бактерий во взвеси проводится также и нефелометрическим методом. В его основе лежит определение светорассеяния (мутности), вызываемого суспензией микробов. Количество света, рассеиваемое этой суспензией, пропорционально числу и размерам клеток при данной длине волны. Разность интенсивности света, падающего на кювету с микробной взвесью и прошедшего через него, по калибровочной кривой переводится в абсолютное количество бактерий. Данный метод может быть использован только для тех микробов, которые в жидких средах дают равномерное помутнение. а сама среда должна быть оптически прозрачной. Другие виды микроорганизмов (риккетсии, микоплазмы, грибки, простейшие, вирусы) имеют свои особенности антигенного состава, но общая характеристика свойств их антигенов остается той же, что и у бактерий (макромолекулярность, наличие антигенных детерминант и т. д.). С целью создания приобретенного искусственного активного иммунитета (человеку) или с целью получения сывороток (животному) вводят антигены (иммуногены) в очищенном виде, в составе убитых или живых микроорганизмов. Это введение редко бывает однократным, а чаще двух- или трех- и многократным по специальным схемам. Для получения сывороток и иммуноглобулинов от животных применяются схемы введения антигенов, в которых предусмотрены дозы, кратность, интервалы между введениями, метод введения (схемы гипериммунизации), а также возможность использования одного из адъювантов.

Адъювантами называют группу веществ как антигенной, так и неантигенной природы, относящихся к различным химическим соединениям и имеющим различное происхождение, которые при введении совместного с антигеном в организм животных и человека оказывают неспецифическое стимулирующее действие на формирование иммунного ответа. К ним относятся вещества неорганической природы: минеральные коллоиды (гидрат окиси алюминия, фосфат кальция, гидрат окиси железа), растворимые соединения (алюмо-калиевые квасцы, хлористый кальций); вещества органической природы: белки (протамины, желатин), липиды (животные, растительные масла и жиры), углеводы (крахмал, танин, пектиновые вещества), сложные вещества (адъювант Фрейнда, комплексы липидов с минеральными сорбентами). Наиболее полно действие адъювантов выявляется при первом соприкосновении организма с антигеном (грундиммунизация), но при последующих инъекциях антигена с адъювантом его стимулирующее действие заметно снижается.

Дата добавления: 2014-10-15