Перевиваемые культуры клеток

Диплоидная культура клеток (полуперевиваемая культура).

Субкультура (вторичная культура клеток).

Первично-трипсинизированные культуры.

Можно готовить культуру из любых органов человека, животных и птиц.

Наиболее часто применяют первичнотрипсинизированную культуру клеток куриных фибробластов. Для этого берут куриный эмбрион в возрасте 10-12 суток, дважды обрабатывают скорлупу спиртом и обжигают. Затем в стерильных условиях извлекают со строжайшим соблюдением асептики зародыш в стерильную чашку Петри, где с помощью пинцетов удаляют голову и кишечник. Кожно-мышечную ткань переносят в стерильную баночку и измельчают ножницами на мелкие кусочки до кашицеобразной массы. Промывают 3-5 раз ФБР для отмывания ткани от крови и переносят в колбочку. Затем к отмытой ткани добавляют 0,25 %-ный раствор трипсина и ставят на 20-30 мин с магнитиком на магнитную мешалку с подогревом до 37° для лучшего разделения клеток (диспергирования). Затем взвесь клеток фильтруют через марлевый стерильный фильтр, для освобождения от неразбившихся крупных -частиц ткани. Центрифугируют для осаждения. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток ресуспендируют в питательной среде для клеток. Полученную взвесь клеток подсчитывают с помощью камеры Горяева. Доводят концентрацию клеток до 200 - 800 тысяч клеток в 1 мл. Добавляют ростовую среду и разливают по стерильным пробиркам или матрацам, которые затем ставят в термостат при температуре 37-38° С. Пробирки ставят в штативе наклонно под углом в 7-10°. В течение первых часов инкубации в термостате клетки оседают и прикрепляются к стенке пробирки или матраца, а позже начинают расти и размножаться, образуя через некоторое время (1-5 дней) на стенке сплошной клеточный монослой. Клетки хорошо видны под малым увеличением микроскопа, а после заражения их вирусом можно видеть изменения в клетках за счет патогенного действия вируса.

Получается из первично-трипсинизированной культуры тканей. Для этого выросший клеточный монослой снимают со стенки пробирки или матраца путем соскабливания или воздействия раствором версена,

затем подвергают трипсинизации для разделения клеток, центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, клеточный осадок ресуспендируют, разливают и вновь выращивают в другой посуде и в новой порции питательной среды. В этом случае вырастает вторичная культура (субкультура).

Получают их из клеток какого-либо органа животных или человека путем многократных перевиваний. Клетки таких культур не носят злокачественного характера, имеют свойства нормальных клеток и обладают диплоидным набором хромосом. Это морфологически однородная популяция клеток с ограниченным сроком жизни, способные многократно перевиваться. Клетки таких культур ткани могут пассажироваться в условиях лабораторий до 10 месяцев, но затем погибают, т. е. подвергаются дегенерации и отмирают.

Это постоянно растущие клетки, не имеющие предела поста

и размножения, они, как правило, носят злокачественный характер. Получают перевиваемые клетки из различных злокачественных опухолей, удается получать и из нормальных тканей путем длительных перевиваний, но впоследующем выделенные клетки приобретают злокачественные свойства. Сейчас есть много видов перевиваемых клеток (клетки Хеля, Нер-1, Нер-2, Дейтроид-6 и др.). Перевиваемые клетки можно в условиях лаборатории сохранить и перевивать годами.

Заражение культур клеток вирусом. Понятие о ЦПД. Титр вируса. Единицы обозначения титра. Принципы титрования вирусов на биологических моделях. В настоящее время применяют два варианта заражения культур клеток:

1 вариант. После того как сформировался монослой удаляют ростовую среду и вносят 0,1 см³. Контакт 1-2 часа при 37°, после чего вирус удаляют, вносят поддерживающую среду и помещают в термостат.

2 вариант. Ростовую среду удаляют из флаконов и вносят 0,1 см³ вируса и 0,9 см³ поддерживающей среды.

За зараженными культурами клеток ведут наблюдение в течение нескольких дней.

Варианты обнаружения вируса в культурах клеток: 1. ЦПД; 2. РГАд; 3. МФА; 4. Электронная микроскопия.

1. Цитопатогенное действие или цитопатогенный эффект — развиваются

дегенеративные изменения в клетках - появляется зернистость. За счет разрушения цитоплазматических мембран образуются многоядерные клетки - симпласты. Пораженные клетки могут группироваться в гроздья и слущиваться с поверхности стекла, образуя пустоты.

2. Реакция гемадсорбции (РГАд) наблюдается в культурах клеток, зараженных гемапглютинирующим вирусом, еще до появления ЦПД. И проявляется в адсорбции эритроцитов на пораженных вирусом клетках.

3. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Культуры клеток выращивают на покровных стеклах в пробирках и заражают их вирусом. Затем извлекают эти стекла из пробирок и наносят специфические вирусу флуорохромные сыворотки.

4. Электронная микроскопия позволяет увидеть непосредственно пораженную вирусом клетку и рассмотреть сами вирионы.

Титрование вируса. Цель проведения титрации.

1. Определить и подобрать точную дозу для заражения чувствительных биологических объектов.

2. При изготовлении живых и инактивированных вакцин.

3. При наработке вирусного антигена для постановки серологических реакций.

Под титрацией вируса понимают определение количества вируса в единице объема вируссодержащего материала (1 см³).

Таким образом, титр вируса - это количество эффективных доз (ЭД) в единице объема вируссодержащего материала.

Титр вируса, поэтому оценивают в средних эффективных дозах ЭД₅о, вызывающих поражение (гибель или заражение) 50% чувствительных биологических объектов.

В зависимости от метода титрации, вида живой системы, на которой титруют вирус и формы проявления инфекционного действия вируса средняя эффективная доза имеет различные единицы измерения.

На лабораторных животных: гибель - (летальная доза)ЛД₅₀, заболевание -(инфекционная доза) ИД₅₀

На куриных эмбрионах: гибель - (эмбриональная летальная доза)ЭЛД₅₀, заболевание -(эмбриональная инфекционная доза) ЭИД₅₀.

При заражении куриных эмбрионов вирусом оспы на ХАО образуются очажки поражения - оспинки. Считают, что один вирион вызывает образование одной оспинки (1 оспообразующая единица) - ООЕ.

На культурах клеток определяют ТЦД ₅₀. При титровании на культурах клеток вируса болезни Марека на монослое появляются уплотнения — бляшки. Считают, что один вирион вызывает образование одной бляшки (бляшко- образующая единица) 1 БОЕ.

Титр вируса по гемагглютинирующим свойствам устанавливают при постановке реакции гемаггютинации (РГА) - (1 гемагглютинирующая единица) ГАЕ.

Для проведения титрации исследуемого вируссодержащего материала делают ряд последовательных 10-кратных разведений. Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса.

. Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном объеме заражают равные группы чувствительных тест объектов. При этом

учитывают тропизм вируса и дозы принятые для данного способа заражения. Однако при определении титра трудно подобрать такие дозы, чтобы они вызывали поражение 50% зараженных объектов.

Дата добавления: 2014-11-25