Микроскопия темного поля

Принцип действия флуоресцентных оптических микроскопов, их достоинства и недостатки.

Флуоресцентный микроскоп —специализированный оптический микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флуоресценции. Молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» (основное) состояние, сопровождающееся излучением света, называют флуоресценцией. Основной принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца заданной определенной полосой длин волн вызывающих флуоресценцию образца. Затем необходимо выделить намного более слабое излучение флуоресценции. В идеально настроенном микроскопе, только свет от флуоресценции должен достичь глаза исследователя или детектора так, чтобы в результате флуоресцентные структуры выделялись с высокой контрастностью на очень темном (или черном) фоне. Проблема состоит в том, что свет возбуждения, как правило, в несколько сотен тысяч, а иногда и в миллион раз ярче, чем свет излучаемой флуоресценции. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа состоит из источника ультрафиолетового излучения, возбуждающего и запирающего светофильтров, теплового (теплозащитного) фильтра и специального люминесцентного объектива. Источник света излучает волны в УФ области спектра, которые проходят через фильтр, где отсекаются волны другого спектрального ряда. УФ лучи попадают на изучаемый препарат и вызывают его люминесценцию. Свет люминесценции проходит через запирающий фильтр, который не пропускает свет возбуждения (ультрафиолетовые волны) и далее формирует изображение в объективе. Для проведения флуоресцентной микроскопии используют метод освещения препарата в проходящем свете и метод освещения в падающем свете. Лучшее разрешение традиционных микроскопов составляет более 200 нм, но позволяет сканировать на некоторую глубину образца, а не только поверхность, как атомный силовой микроскоп.

Для микроскопии в темном поле при­меняются особые конденсоры, у которых центральная часть линзы за­темнена, за исключением узкой полоски по периферии. При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой.

Преимущество микроскопии в темном поле зрения состоит в том, что при этом можно видеть объекты более мелкие. Кроме того, в тем­ном поле зрения лучше наблюдать в живом состоянии такие микробы, как лептоспиры, которые в водной среде не преломляют света и поэто­му в проходящем свете совершенно прозрачны. Основным ограничивающим фактором метода является то, что только малая часть падающего света в итоге формирует изображение, поэтому необходимо применять достаточно мощные источники света, что иногда приводит к повреждениям образца (сейчас иногда используют лазеры). Значительное ограничение метод накладывает на разрешающую способность системы — апертура объективов, работающих по методу темного поля существенно ниже светлопольных, так как она не должна перекрывать затемненную часть апертуры конденсора. Применение: Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов — простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток. Темнопольная микроскопия в последнее время используется в производстве компьютерных мышей с тем чтобы обеспечить работу оптических мышей в том числе и на прозрачных стёклах, имеющих микроскопические дефекты или пыль на поверхности.

8) Ближнепольная оптическая микроскопия -оптическая микроскопия, обеспечивающая разрешение лучшее, чем у обычного оптического микроскопа. Повышение разрешения БОМа достигается детектированием рассеяния света от изучаемого объекта на расстояниях меньших, чем длина волны света. В случае, если зонд (детектор) микроскопа ближнего поля снабжен устройством пространственного сканирования, то такой прибор называют сканирующим оптическим микроскопом ближнего поля. Такой микроскоп позволяет получать растровые изображения поверхностей и объектов с разрешением ниже дифракционного предела. Зондом служит оптический волновод (световолокно), сужающийся на том конце, который обращен к образцу, до диаметра меньше длины волны света. Световая волна при этом не выходит из волновода на большое расстояние, а лишь слегка “вываливается” из его кончика. На другом конце волновода установлены лазер и приемник отраженного от свободного торца света. При малом расстоянии между исследуемой поверхностью и кончиком зонда амплитуда и фаза отраженной световой волны меняются, что и служит сигналом, используемым при построении трехмерного изображения поверхности.

Если заставить свет пройти через диафрагму диаметром 50-100 нм и приблизить ее на расстояние несколько десятков нанометров к поверхности исследуемого образца, то, перемещая такой «источник света» по поверхности от точки к точке (и обладая достаточно чувствительным детектором), можно исследовать оптические свойства данного образца в локальной области, соответствующей размеру отверстия.

Именно так устроен сканирующий ближнепольный оптический микроскоп (СБОМ). Роль отверстия (субволновой диафрагмы) обычно выполняет оптоволокно, один конец которого заострен и покрыт тонким слоем металла, везде, кроме небольшой области на самом кончике острия (диаметр «незапыленной» области как раз составляет 50-100 нм). С другого конца в такой световод поступает свет от лазера.

Схема устройства ближнепольного оптического микроскопа

С помощью СБОМ можно изучать оптические явления с пространственным разрешением 30-50 нм. Отличительной особенностью СБОМ является принципиальная необходимость работать с очень слабыми сигналами.

Дата добавления: 2014-11-20