Исследования в опытах на прокариотах. Тест Эймса

Изучение мутагенной активности

Условия действия мутагенов на клетки

Все клетки организма находятся в одной из фаз клеточного цикла:

1. Покоя (фаза G₀): клетка функционирует или покоится (большинство соматических неделящихся клеток);

2. Синтеза клеточных компонентов, необходимых для последующего синтеза ДНК (фаза G₁): идет накопление необходимого количества пуриновых и пиримидиновых оснований и других химических компонентов ДНК. В делящейся клетке процесс занимает до 40% общего времени цикла клеточного деления;

3. Синтеза ДНК (фазаS): осуществляется "сборка" новой молекулы ДНК из наличествующих в клетке компонентов. Процесс занимает до 39% времени клеточного цикла.

4. Синтеза клеточных компонентов для митоза (фазаG₂). В частности синтезируется мономеры и полимер тубулина и т.д. Процесс занимает около 19% времени цикла делящейся клетки.

5. Митоза (фазаM): разделение генетического материала между вновь образующимися дочерними клетками; клеточное деление. Процесс занимает 2% времени.

Часть химические вещества способны вызывать мутации лишь тех клеток, которые находятся в определенной фазе цикла, это так называемые цикло-специфичные вещества. Другие действуют на генетический аппарат не зависимо от того, в каком периоде клеточного цикла находится клетка (цикло-неспецифичные). Такая особенность в действии веществ определяется механизмом, посредством которого токсикант повреждает ДНК (см. выше). К числу цикло-неспецифичных принадлежат мутагены, способные вызывать химическое повреждение нуклеотидов (алкилирующие агенты и химические модификаторы нуклеотидов). Все остальные мутагены являются цикло-специфичными.

Изучение мутагенной активности химических веществ осуществляется в опытах in vitro на прокариотических и эукариотических клетках, путем непосредственного изучения степени повреждения ДНК, и выявления хромосомных аберраций у животных, подвергшихся действию токсикантов.

В основе теста, разработанного Брюсом Эймсом, лежит способность мутагенов вызывать обратную мутацию измененного штаммаSalmonella typhimurium, неспособного к биосинтезу гистидина. Микроорганизмы данного штамма не растут в среде, не содержащей гистидин, однако под влиянием мутагенов вновь приобретают эту способность, свойственную исходному штамму сальмонелл (обратная мутация). В настоящее время созданы специальные штаммы, позволяющие выявлять мутации типа "замещение основания" (штамм ТА-1531) и типа "сдвиг цепи нуклеотдидов" (штамм ТА-1537, ТА-1538).

Тест осуществляется на суспензии бактериальных клеток в расплавленном при 45⁰ агаре. В инкубационную среду (не содержащую гистидин) добавляют токсикант. К части проб добавляют также фракцию микросом, выделенных из гепатоцитов крыс, предварительно обработанных полихлорированными бифенилами, с целью индукции цитохромовР-450 (фракцияS-9). Смеси разливают по чашкам Петри. Число бактерий, приобретших вследствие обратной мутации способность синтезировать гистидин, оценивают путем подсчета колоний, развившихся в инкубате. Исследуемое вещество оценивается в нескольких концентрациях (установление дозовой зависимости эффекта). В итоге получается информация о наличии мутагенности у исходного вещества (среды без фракцииS-9) и его метаболитов (среды, содержащие фракциюS-9). Недостатком метода является сложность получения количественных характеристик мутагенной активности обследуемых веществ для млекопитающих и человека.

В настоящее время тестирование проводят и на других биологических объектах (прямая и обратная мутацияEscherichia coli,прямая мутация сальмонелл).

Дата добавления: 2014-12-08