Экспериментальное изучение

Выявление действия токсикантов на репродуктивную функцию.

Цитостатики

Средства химеотерапии новообразований обладают свойствами тератогенов, если их действие приходится на ранний период беременности. Среди установленных тератогенов: алкилирующие агенты (бисульфан, хлорамбуцил, циклофосфан, мехлорэтамин) и антиметаболиты (аминоптерин, азасерин, азатиоприн, азауридин, циторабин, 5-фторурацил, метатрексат). Риск родить ребёнка с врожденными дефектами у женщин, принимающих цитостатики в терапевтических дозах составляет 1: 10 - 1: 50, в зависимости от применяемого средства. Действие веществ проявляется спонтанными абортами, мертворождением, высокой смертностью новорожденных. Дефекты развития у детей включают нарушения со стороны ЦНС, костей лицевого и мозгового черепа, аномалии развития почек и мочеточников, конечностей. Отмечено, что среди медицинских сестер, родивших детей с аномалиями развития, вероятность контакта с цитостатиками в 2,6 раза выше, чем в группе сестер, родивших нормальных детей. У медицинских работников, постоянно контактирующих с цитостатиками, в клетках крови обнаруживается повышенная частота хромосомных аберраций.

С другой стороны отсутствуют убедительные данные, указывающие на неблагоприятное действие цитостатиков (по показателю "увеличение риска тератогенеза") на организм отца до, или в период, зачатия.

Оценить токсическое действие веществ на репродуктивные функции чрезвычайно сложно, поскольку многообразны и сложны механизмы и условия, приводящие к неблагоприятному эффекту. В настоящее время разработано большое количество протоколов опытов, в рамках которых подобные исследования выполняются. Обычно они осуществляются в четыре этапа:

1. Изучение оплодотворяемости и общей репродуктивности - в опытах на одном поколении животных;

2. Изучение оплодотворяемости и общей репродуктивности - в опытах на нескольких поколениях животных;

3. Изучение тератогенной активности веществ;

4. Выявление перинатальной и постнатальной токсичности.

Опыты выполняются на животных, содержащихся в строго контролируемых условиях.

Изучение оплодотворяемости и репродуктивности. Опыты выполняют на лабораторных животных, как правило, крысах. Обычно 20 самцам (на каждую из исследуемых доз) вводят изучаемый токсикант в течение 60 суток до спаривания, а также 20 самкам - в течении 14 суток до спаривания. Временные периоды выбраны исходя из сроков завершения полного цикла процессов сперматогенеза и овуляции. После спаривания животных обработка токсикантом самок продолжается весь период беременности и до момента прекращения лактации.

Изучаемое вещество добавляют в корм или питьевую воду. Дозовая зависимость определяется в диапазонах: дозы, вызывающие пороговые токсические эффекты у животных-родителей (максимальная исследуемая) - дозы, действующие в естественных условиях на человека (минимальная исследуемая). После спаривания самцов умерщвляют и исследуют; половину самок умерщвляют в середине периода вынашивания и обследуют на предмет оценки преимплантационной и постимплантационной летальности плода. Другой половине самок предоставляют возможность выносить и выкормить потомство. После завершения периода выкармливания крысят умерщвляют и подвергают обследованию с целью выявления дефектов развития. В контрольных экспериментах спаривают животных не подвергшихся действию токсикантов (только самцы, только самки, оба родителя).

Выраженность токсического действия исследуемого вещества на репродуктивные функции оценивают по следующим показателям:

- преимплантационная гибель - количество желтых тел в яичниках, относительно числа мест имплантации яйцеклеток в матке;

- постимплантационная гибель - количество участков резорбции яйцеклеток в матке, относительно общего числа мест имплантации;

- морфологические изменения в репродуктивных органах животных;

- продолжительность периода беременности;

- численность приплода и его состояние, соотношение живых и мертвых новорожденных крысят, вес крысят, наличие видимых уродств;

- характеристика развития новорожденных: прибавка в весе, смертность и т.д.

- наличие морфологических дефектов формирования органов и тканей у крысят после завершения выкармливания матерью.

Все показатели оцениваются количественно, обрабатываются статистически и сравниваются с контролями. Существенные, статистически достоверные нарушения хотя бы одного из оцениваемых показателей свидетельствует о репродуктивной токсичности исследуемого вещества.

Значительно более трудоемким является протокол исследования, предполагающий проследить неблагоприятный эффект в нескольких поколениях. Основная сложность состоит в правильном формировании исследуемых групп и групп сравнения. С содержанием таких протоколов можно познакомиться в специальной литературе.

Изучение тератогенной активности. В ходе исследования токсикант можно вводить весь период беременности, от зачатия до родов. Однако обычно ограничиваются изучением последствий действия вещества в период наибольшей чувствительности плода - период органогенеза. Опыты выполняют, как правило, на грызунах, чаще крысах. Способ назначения и дозы токсиканта - аналогичны, описанным выше. Наиболее типичная форма протокола представлена в таблице 7.

Таблица 7. Типовой протокол исследования тератогенной активности и перинатальной/постнатальной токсичности

ТЕРАТОГЕНЕЗ

Самки Самцы

СПАРИВАНИЕ

ВЫНАШИВАНИЕ Самкам в течение 6 - 15 дня беременности вводят токсикант. Мать и потомство умерщвляют на 20 сутки

ПЕРИНАТАЛЬНАЯ/ПОСТНАТАЛЬНАЯ ТОКСИЧНОСТЬ

Самки Самцы

СПАРИВАНИЕ

ВЫНАШИВАНИЕ Самкам, начиная с 15 дня беременности, вводят токсикант

ЛАКТАЦИЯ Введение токсиканта до завершения лактации (21 сутки). Умерщвление матери и потомства

В процессе исследования оценивают структурные нарушения развития плода (таблица 8), величину эмбрио-фетальной летальности.

Таблиц 8. Некоторые аномалии развития, выявляемые входе оценки тератогенности ксенобиотиков

А. Дефекты, выявляемые при общем осмотре 1. Череп, головной и спинной мозг - энцефалоцеле - протрузия мозга через дефекты костей черепа - экзэнцефалия - отсутствие костей черепа - микроцефалия - малые размеры головы - гидроцефалия - увеличенные объемы желудочков мозга - spina bifida - несращение дуг позвонков 2. Нос - увеличение носовых ходов - отсутствие носовой перегородки 3. Глаза - микрофтальмия - малый размер глаз - анофтальмия - отсутствие глаз - отсутствие век 4. Челюсти - микрогнатия - малый размер нижней челюсти - агнатия - отсутствие нижней челюсти - аглоссия - отсутствие языка - астомия - отсутствие ротового отверстия - расщепленная губа 5. Небо - расщепленное небо 6. Конечности - микромелия - укорочение конечностей - гемимелия - отсутствие отдельных костей конечностей - фокомелия - отсутствие всех длинных костей конечностей

Б. Дефекты внутренних органов 1. Кишечник - пупочная грыжа - эктопия кишечника - экструзия кишечника за пределы брюшной полости 2. Сердце - декстрокардия - расположение сердца в правой стороне грудной полости 3. Легкие - увеличение легких - уменьшение размеров легких 4. Почки - гидронефроз - почки увеличены, заполнены жидкостью - агенезис - отсутствие одной или обеих почек - нарушение формы органа

В. Нарушения скелета 1. Пальцы - полидактилия - наличие дополнительных пальцев - синдактилия - срастание пальцев - олигодактилия - отсутствие одного и более пальцев - брахидактилия - укорочение пальцев 2. Ребра - дополнительные ребра - сросшиеся ребра - разветвление ребер 3. Хвост - укорочение хвоста - отсутствие хвоста - нарушение формы хвоста

Поскольку практически все выявляемые нарушения встречаются и у интактных животных, а также могут быть вызваны факторами не химической природы, большое внимание необходимо уделять формированию репрезентативных контрольных групп и статистической обработке получаемых результатов.

В качестве дополнения к предлагаемому протоколу рассматривается возможность использования методов оценки функционального состояния животных, родившихся от самок, подвергшихся воздействию исследуемого химического вещества. Постнатальная оценка функционального состояния животных включает определение скорости роста, состояния почек, печени, сердечно-сосудистой, дыхательной систем, ЦНС.

Изучение перинатальной и постнатальной токсичности. Исследование выполняют на беременных самках белых крыс (таблица 7). 20 животным (на каждую исследуемую дозу) вводят исследуемый препарат в течении последней трети беременности и периода лактации. Способы введения и дозы испытываемых веществ подбирают по общим правилам (см. выше). Оценивают продолжительность беременности, число и размеры новорожденных, скорость роста приплода и т.д. Целесообразно использовать морфологические и физиологические методы оценки состояния здоровья крысят. Результаты обрабатывают статистически и сравнивают с контролями.

Установление тератогенности ряда токсикантов рождает представление о том, что основной причиной дефектов развития являются производственные факторы и факторы окружающей среды. На самом деле это не так. Реальная оценка потенциальной опасности токсиканта для человека - сложная задача. Хотя в опытах на животных проделана большая работа по выявлению тератогенов, мутагенов, веществ нарушающих репродуктивную функцию, полностью переносить полученные данные на человека не представляется возможным. Такой перенос невозможен в силу целого ряда обстоятельств: различий в строении генома у представителей видов лабораторных животных и человека; различий чувствительности развивающихся тканей к отдельным токсикантам; межвидовых различий токсикокинетики ксенобиотиков, включая особенности метаболизма (это имеет значение поскольку у разных видов возможно образование различных метаболитов одного и того же токсиканта, могут существенно различаться временные параметры действия веществ); различием физиологических механизмов реализации репродуктивной функции, продолжительности отдельных периодов развития плода и т.д.

Дата добавления: 2014-12-08