Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции

Процедура посева

1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут.

2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.

3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 45 минут.

4. Отмывка клеток питательной средой.

5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей циклогексимид.

6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С.

7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

Реальный срок получения результатов этим методом - семь дней.

В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.

Схема метода выявления устойчивости хламидий трахоматис к антибактериальным препаратам

-Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, заражают чувствительные клетки.

-К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик.

-Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 ° С.

-Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура длительная, занимает по времени две недели.

Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР для выявления хламидий трахоматис. Особое внимание при его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам правильной интерпретации получаемых результатов. Экстремально высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают эту методику во многом революционной в лабораторной диагностике. Основными мишенями при выявлении хламидий трахоматис являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены.

Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94 ° С происходит разделение цепей ДНК, затем при 56-58 ° С - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72 ° С протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5’ –3’. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов нараСотать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, дОстаточном для ее детекцШи с помощью электрофореза или аЫьтернативными ему технологиями

По сравнению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

-высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной диагностической системе;

-высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);

-химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов,

-возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 часов.

Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в холодовом термоконтейнере или термосе со льдом. Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость оборудования для проведения анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных инфекционных агентов.

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Следует иметь не менее двух комнат

-пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении), в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

-пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации, в ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими растворами.

Дата добавления: 2014-12-16