Рестрикционные ферменты и палиндромы

Бактерии и фаги, которые их атакуют, находятся в состоянии непрерывной химической войны. Бактерии, оказывающие сопротивление фаговой инфекции, получают преимущество в борьбе за существование, и они выживают с большей вероятностью. Точно так же фаги, преодолевающие защитные барьеры бактерий, получают определенное преимущество. Бактерии производят рестрикционные ферменты — эндонуклеазы (рестриктазы), которые атакуют молекулы ДНК, разрезая их фосфодиэфир-ные связи (эндо- означает, что они разрезают молекулу изнутри, а не по краям). Эти ферменты образуют рестрикционную систему, которая разрушает фаговые ДНК. Сейчас разработаны простые и быстрые методы определения последовательности молекул ДНК. Секвенирование ДНК показывает, что каждая эндонкулеаза очень специфична и что она разрезает только очень короткую последовательность ДНК, чаще всего так называемый палиндром. Палиндром — это последовательность букв, которая одинаково читается как обычным способом, так и задом наперед подобно известным фразам: «А роза упала на лапу Азора» или «А кит на море — романтика!» Молекулярный палиндром — это последовательность оснований, которая также читается одинаково в любом направлении, например:

Фермент, атакующий именно эту последовательность, синтезируется штаммом Е. coli RY13, так что если фаг с такой последовательностью попытается атаковать бактерию, фермент разрежет его ДНК на фрагменты и остановит инфекцию. На рис. 8.3 указаны последовательности, которые подвергаются атаке со стороны ферментов, выделенных из различных типов бактерий. (Источник каждого фермента обозначен трехбуквенным сокращением по названию бактерии, например, фермент, выделенный из Е. coli RY13, называется EcoRI.)

Почему в таком случае бактерии не разрушают собственную ДНК? В них параллельно рестрикци-онной включается модификационная система, ферменты которой добавляют метиловую группу (СН₃) к аденинам последовательности, блокируя тем самым действие рестрикционной эндонуклеазы. Некоторые фаги добавляют метиловую группу к своей ДНК и становятся невосприимчивыми к такой эн-донуклеазе.

Секвенирование ДНК ДНК можно поделить на фрагменты во время электрофореза (рис. 8.3). При этом используют вещество агарозу, похожее на агар, который используют в качестве питательной смеси. Смесь молекул ДНК помещают на гель агарозы. Когда через гель пропускают электрический ток, отрицательно заряженные молекулы ДК устремляются к положительному полюсу и более мелкие молекулы движутся быстрее. Этот метод настолько чувствителен, что с его помощью можно определить длину молекулы

Рис. 8.3. Молекулы ДНК можно легко разделить электрофорезом в геле арагозы. Чем меньше фрагмент, тем быстрее он перемещается

вплоть до отдельного основания. Увидеть распределение молекул можно, нанеся на гель краситель, который связывается исключительно с ДНК. Основной принцип определения последовательности, или секвенирования, ДНК исходит из двух главных положений. Во-первых, синтез цепи ДНК начинается с короткого участка-лраймера (затравки) и продолжается в направлении 5'—>3'; во-вторых, очередной нукпеотид добавляется к цепи, только если у рибозы на конце имеется атом кислорода в позиции 3'. Однако можно синтезировать дидезоксинуклеотиды (ddN) без этого атома кислорода; их можно включать в растущую цепь, но только после них другие нуклеотиды включаться не будут и рост цепи прекратится. Поэтому ученые начинают с отдельной цепи ДНК, к которой добавляют короткую комплементарную затравку, ДНК-полимеразу и смесь четырех нуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК. (В смеси содержится достаточное количество каждого рода вещества.) Обычно конец 5' помечается ³²Р, поэтому можно определить местонахождение ДНК с помощью авторадиографии. Затем эту смесь разделяют на четыре пробирки. В одну добавляют немного ddA, в другую — ddC, в третью — ddG, в четвертую ddT. Синтез комплементарной цепи ДНК происходит в каждой пробирке, удлиняя начальные цепочки-затравки, но рост каждой молекулы заканчивается тогда, когда к ней случайным образом присоединяется дидезоксинуклеотид. Поэтому если в последовательности имеется, например, десять положений для ти-мина Т, то в большинстве из них окажется обычный тимин dT, при этом добавленного ddT хватит, чтобы создать молекулы десяти различных размеров, каждая из которых заканчивается тимином. Если вещество из пробирки ddT поместить в гель, то при электрофорезе молекулы ДНК разделятся на десять частей и образуют десять полосок. То же самое произойдет и с молекулами ДНК из других пробирок. Полную последовательность ДНК можно прочитать, начиная непосредственно с самой дальней полоски и заканчивая самой ближней (рис. 8.4).

Последовательность

Рис. 8.4. Один из методов определения последовательности молекулы ДНК

В четырех пробирках синтезируются цепи ДНК, комплементарные очищенным одиночным цепям, причем в каждой пробирке содержатся различные дидезоксинуклеотиды. Получившиеся фрагменты распределяют в зависимости от размера и всю последовательность прочитывают по распределению полос.