Открытие вирусов бактерий. Эксперименты Ф.Туорта и Ф.Дэреля

Эксперимент А. Херши и М. Чейз и значение полученных ими результатов.

То, что внутрь клетки проникает только ДНК было чётко продемонстрировано в эксперименте Альфреда Херши и Марты Чейз 1952, которые показали, что клетку при заражении ее фагом проникает фаговая нуклеиновая кислота, а белок остается вне клетки в виде безнуклеинового фантома или тени фага.

Клетки инфицируются фагом, содержащим метки: нуклеиновую кислоту, содержащую изотоп фосфора радиоактивный и фаговые белки - изотоп серы. Меченые фаги используются для заражения интактных клеток, выращенных в обычной нормальной среде, не содержащей метки. После истечения времени необходимого для прикрепления вирусной частицы к поверхности бактериальной клетки, порядка 5 минут, может чуть больше, смесь фагов и бактерий центрифугируется и определяется метка с помощью соответствующих счетчиков в осадке и надосадочной жидкости. Как показали эксперименты 80% метки фосфора определяется в бактериальных клетках, которые тяжелее чем фаговые частицы и оседают при центрифугировании, и 1% в осадке серы. Вся метка по сере оказывается в надосадочной жидкости, это так называемые безнуклеиновые фантомы фагов или фаговые тени, не содержащие нуклеиновых кислот. Во всех учебных пособиях пишут, что в клетку проникает только ДНК, но это не совсем верно, потому что небольшое количество внутреннего белка фаговой частицы при таком заражении проникает внутрь клетки. Это своего рода пробочка на ригидном стержне хвостового отростка, которая попадает вместе с молекулой ДНК внутрь клетки. Таким образом, фаги, которые заражают бактериальную клетку, вводят в клетку хозяина только нуклеиновую кислоту. И все процессы, протекающие впоследствии в такой зараженной клетке детерминируются информацией заключенной в проникшей фаговой ДНК.

Однако в 1915-1917 годах, двумя исследователями Фридриком Туортом и Феликсом Дэрелем были обнаружены вирусы таких примитивных организмов как бактерий. Дерель назвал обнаруженный им, независимо от Туорта вирус бактерий – бактериофагами, в переводе пожиратель бактерии. В принципе первооткрывателем бактериофагов, сокращенно фагов надо считать Туорта, ибо он в 1915 году изучая стафилококки обнаружил так называемое явление получившее название стекловидного перерождения колоний стафилококков, когда вырастающие колонии на плотной питательной среде были изъедены прозрачными участками. Если эти прозрачные участки, петлей переносили на нормальную колонию, то наблюдалось же опять такое же стекловидное перерождение. Туорт получал фильтраты, которые содержали литическое начало, вызывающее повторение эффекта происходящего у стафилококков. И одним из объяснений данного явления было то, что это фильтрующийся вирус аналогичный вирусам растений и животных. Правда Туорт свои исследования не продолжил и они не привлекли должного внимания.

А в 1917 году Дерель работая в Пастеровском институте в Париже, обнаружил такой литический объект при изучении возбудителя дизентерии. Ему поручили разобраться в вспышке дизентерии в одном из военных госпиталей в пригороде Парижа. Ну в 1917 году как вы знаете, шла первая мировая война и Деррель занялся изучением этой штучки в одном из госпиталей. Теоретической предпосылкой, или как сейчас принято говорить – рабочей гипотезой при начале его исследования явилось представление, возникшее в то время в среде микробиологов, что некоторые заболевания, в частности чума свиней вызываются совместным заражением бактерией и фильтрующимся вирусом. Вот такое комбинированное заражение животных приводило к развитию чумы. Ну, видимо факт этот основывался на находках: обнаруживали какой-то нефильтрующийся инфекционный агент и сопутствующий микроорганизм. Так вот исходя из этих представлений Дерель попытался тоже выявить такое совместное заражение в случае заболевания солдат дизентерией. С этой целью он фильтровал испражнения больных через бактериальный фильтр, получая таким образом как он полагал – вирус. Добавлял этот вирус к молодым культурам возбудителя дизентерии Shigella disenteria. Эту смесь он помещал в термостат до следующего дня в надежде воспроизвести заражение лабораторных животных и вызвать у них заболевание. На следующий день заметил, что в некоторых пробирках произошло просветление. Никакого бактериального роста не было. Это была бактериальная культура в которую было добавлено небольшое количество фильтрата от больных. Повторяя эти эксперименты он показал, что вот в этих просветленных культурах находится некий литический агент, растворяющий бактерии дизентерии. Изучение данного агента привело к довольно интересным результатам и интерпретация полученных до сих пор остаётся в силе, и не подверглась никаким изменениям. Во-первых было показано что данный литический агент мог лизировать бактерии дизентерии взвешенные в физиологическом растворе, т е без всяких питательных веществ в среде. И в таких условиях бактерии лизировались. Если же бактерии предварительно были инактивированы - убиты, то никакого лизиса при добавлении к таким убитым бактериям в фильтрате не возникало. На основании этого он сделал вывод, что данный литический агент может размножаться только в живых бактериях, вызывая их лизис и растворение. И на основании это ввёл термин – бактериофаг – пожиратель бактерий.

Весьма интересный эксперимент был поставлен Дерелем в следующей аранжировке. Если он добавлял в небольшое количество фильтрата к бактериальной взвеси, а затем из этой смеси производил высев на плотную питательную среду в чашке Петри на которой хорошо растут бактерии Disenteria то он обнаружил на сплошном газоне появлялись отдельные прозрачные круглой формы участки небольших размеров порядка 1-2 мм, которые он назвал бляшками. Эти вот прозрачные участки отсутствия роста, по мнению Дереля являлись колониями бактериофагов. Он ввёл термин негативные колонии фагов. Из этих бляшек можно было взять материал петлёй и добавить его к жидкой культуре дизентерийной бактерии и вызвать в последующем лизис всех бактериальных клеток. Т.е именно в этих бляшках содержатся бактериофаги.

Следующий эксперимент заключался в такой его аранжировке: готовилась смесь бактерий и фильтрата – бактериофага и высевалась на чашки Петри через разные промежутки времени от начала смешивания и инкубирования в термостате. При высеве сразу после смешивания развивался сплошной газон с отдельными бляшками. Через час примерно такой же высев давал уже большее количество бляшек. Порядка нескольких десятков. Через 2 часа таких бляшек регистрировалось уже более сотни. А через 4 часа никакого газона вообще не регистрировалось. Все бактерии были лизированы. На основании этого он сделал вывод, что данный агент размножается во взвеси бактериальной и представляет собой некий корпускулярный фактор. Т е это какие-то маленькие частички. И вот эти постулаты Дереля, что бактериофаг репродуцируется в живых клетках, что он представляет собой корпускулярное начало, а не какой-то там … и может рассматриваться вирус бактерии. Вот эти негативные колонии или бляшки формируются в р-те заражения бактерии бактериофагом, и после репродукции бактериальной клетки лизиса клетки и выхода фаговых частиц во внешнюю среду инфецируютя близлежащие клетки в них происходит то же самое. В р-те формируется негативная колония фага.

Размеры бляшек определяются рядом факторов: размерами фаговх частиц. Питательными компонентами среды. Влажностью среды, температурными факторами и т. п. Во всяком случае Дерелем было постулировано что этот литический агент является бактерильным вирусом. На основании своих исследований Дерель выдвинул представление, что невосприимчивость организма к инфекционным заболеванием связана с появлением бактериофага, который уничтожает возбудителя, а не какие-то там иммунные антитела и другие факторы резистентности. И долгое время бактериофаги использовались в качестве терапевтического и превентивного средства при борьбе с инфекционными заболеваниями. Однако после открытия антибиотиков получения сульфаниламидов бактериофаги перестали использовать, как лечебное средство, ибо в ряде случае оказывалась неэффективность таких терапевтических мероприятий.

Дата добавления: 2014-12-24