Проведение ПЦР с детекцией в реальном времени

Проведение обратной транскрипции.

Измерение концентрации РНК.

Готовили Раствор А (199 мкл буфера для разведения РНК и 1 мкл флуоресцентного красителя RNA reagent, состав которых фирма-производитель Qiagen не раскрывает. После этого готовили рабочие растворы нулевого стандарта и 10 нг/мкл РНК, добавляя 10 мкл каждого стандарта к 190 мкл Раствора А. Затем готовили растворы образцов, добавляя 1 мкл исследуемой РНК к 199 мкл Раствора А. Проводили калибровку с помощью рабочих растворов стандартов на флюориметре Qubit, а затем измеряли концентрацию РНК в растворах исследуемых образцов. Длина волны возбуждения комплекса краситель-РНК 644 нм, а эмиссии 673 нм.

Расчет концентрации проводили по формуле:

Для денатурации РНК 1 мкг суммарной РНК помещали в пробирку и инкубировали 10 мин при 70^оС. После чего сразу помещали на лед на 3 мин. Добавляли смесь, приготовленную заранее, в которую входили:

MgCl₂ (25 мМ) 4 мкл

Десятикратный буфер 2 мкл

Смесь дНТФ (10 мМ) 2 мкл

Ингибитор рибонуклеаз 0,5 мкл

AMV Обратная Транскриптаза 0,5 мкл

Oligo (dT)₁₅ 1 мкл

С помощью воды доводили до 20 мкл, учитывая объем суммарной РНК.

Инкубировали 15 мин при 42^оС для инициации реакции, 5 мин при 95^оС для элонгации синтезируемой кДНК и еще 5 мин на льду. Хранили полученную кДНК при -20^оС до проведения ПЦР в реальном времени.

Готовили смесь:

Смесь пробы и праймера НАДФ(Н) хинон оксидоредуктазы 1 мкл

Проба гена «домашнего хозяйства» GAPDH 0,5 мкл

Праймер гена домашнего хозяйства GAPDH 0,5 мкл

2,5 кратный реакционный буфер 10 мкл

Вода 11,5 мкл

Полученную смесь помещали в лунку 96-луночного планшета, добавляли 1,5 мкл исследуемой кДНК и проводили ПЦР с детекцией в реальном времени. Температурный режим реакции включал… первый цикл, каждый цикл, последний цикл, когда снимали сигнал.

ПЦР в реальном времени проводился в следующем режиме:

Картинка с примером кривой.

Оценка уровня экспрессии гена Nqo1 в разных группах (метод 2^-ΔΔСТ). Методику расчета перенести в методы

Для сравнения уровня экспрессии в исследуемых образцах использовали метод относительного количественного определения экспрессии гена (метод 2^-ΔΔСТ) (Livak K., Schmittgen T., 2001). Суть метода заключается в том, что…

Уравнение, которое описывает накопление продукта ПЦР:

где - количество молекул-мишеней на цикле n, - начальное количество молекул-мишеней. – эффективность амплификации молекул-мишеней, n –номер цикла. Пороговый цикл реакции (С_Т) цикл начала увеличения флуоресценции, т.е. накопление молекул-мишений, на котором сигнал уже достоверно отличим от приборного шума, но при этом еще наблюдается экспоненциальный рост сигнала

где пороговое количество молекул-мишеней, пороговый цикл при амплификации молекул-мишеней, а это константа. Аналогичное уравнение получаем для реакции накопления продуктов амплификации гена сравнения (reference, ген «домашнего хозяйства» - описать, что это такое в сути метода)

где это пороговое количество молекул контроля (гена домашнего хозяйства), - начальное количество молекул контроля, эффективность амплификации молекул контроля, пороговый цикл для амплификации молекул контроля, а это константа.

Если поделить на , получим

Сделаем допущение, что эффективности реакций ПЦР-РВ во всех образцах равны.

или

где это нормализованное количество молекул-мишений, а равна разности пороговых циклов мишеней и контроля.

Так, получаем экспрессию

Завершающий шаг – это деление для образца q (кормление которого производилось исследуемым сырьем) на для калибровочного образца (cb) (которого никаким исследуемым сырьем не кормили):

Где .

Для ампликонов с протяженностью менее чем 150 bp и для которых концентрация праймера и Mg²⁺ подобраны верно, эффективность близка 1. Поэтому, количество мишеней, нормализованное на внутренний контроль и отнесенное к калибратору, выражается формулой

В нашей работе была достигнута эффективность, равная ….. для амплификации Nqo1 и …. для амплификации Gapdh.

Дата добавления: 2015-04-25