Количественный анализ полученных фракций

Высвобождение аминокислот из колонки осуществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличивающейся ионной силой (т.е. с увеличением концентрации NaCl) и рН. При увеличении рН аминокислоты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и прочность связи с отрицательно заряженными частицами смолы.

Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении рН и ионной силы. Собирая с нижнего конца колонки раствор (элюат) в виде небольших порций, можно получить фракции, содержащие отдельные аминокислоты.

Рис. 1-4. Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии. А. Хроматограсрическая колонка, наполненная катионообменной смолой. Б. Этапы разделения аминокислот: 1 - присоединение аминокислот к частицам смолы; 2 - высвобождение аминокислот при определённом значении рН и концентрации NaCI.

Количество каждой из аминокислот в данном белке определяют, нагревая отдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты, поэтому по спектрофотометрическому измерению света, поглощённого нингидриновыми производными, можно определить содержание каждой аминокислоты в гидролизате данного белка.

В настоящее время процесс разделения и количественного определения аминокислот в гидролизате белка полностью автоматизирован и осуществляется в специальном приборе - аминокислотном анализаторе.

2. Определение аминокислотной
последовательности в белке

Дата добавления: 2015-05-07