Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Микробиологическая чистота готовых лекарственных средств

Читайте также:
  1. I.Средства, угнетающие секрецию хлористоводородной кислоты
  2. III. Средства, понижающие тонус шейки матки
  3. АВТОМОБИЛЬНЫХ ТРАНСПОРТНЫХ СРЕДСТВ
  4. Амортизация основных средств
  5. Амортизация основных средств
  6. Анализ использования основных средств
  7. Ареста и изъятия денежных средств
  8. Аудит денежных средств
  9. Аудит основных средств
  10. БРЕШИ, ВЫЯВЛЕННЫЕ ПОСРЕДСТВОМ ЭТОЙ МОДЕЛИ
  11. БУДЬ САМИМ СОБОЙ! ВЕДИ СЕБЯ НЕПОСРЕДСТВЕННО!
  12. Ведомость отпуска лекарственных препаратов аптекам

Табл.27.

Категория Препараты Рекомендуемые требования
Лекарственные препараты, к которым предъявляется требование «стерильность» Препараты должны быть стериль­ными
• Для применения местно, наружно, интравагиналь-но • Для введения в полости уха, носа • Для введения в дыха­тельные пути • Трансдермальные пла­стыри За исключением тех лекар­ственных препаратов, ко­торые должны быть сте­рильными • Общее число аэробных бактерий и грибов суммарно - не более 102 в 1 г или в 1 мл, или на 1 пла­стырь (включая клейкую сторону и основу) • Отсутствие энтеробактерий и некоторых других грамотрица-тельных бактерий на 1 пластырь (включая клейкую сторону и ос­нову) • Не более 101 энтеробактерий и некоторых других грамотрица-тельных бактерий в 1 г или 1 мл для других препаратов • Отсутствие Pseudomonas aerugi­nosa в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу)



В последующих разделах этой главы будут рассмотрены морфолого-биохимические особенности микроорганизмов (в порядке их перечис­ления в Определителе бактерий Берджи), содержание которых регламен­тировано для продукции фармацевтической промышленности, в связи с существующими методами их выделения и идентификации, а также их значение в паталогии человека.

Грамотрицательные аэробные (микроаэрофильные палочки)

Род Pseudomonas. Прямые или слегка изогнутые, но не спираль­ные палочки 0,5-1,0 х 1,5-5,0 мкм. Подвижны (полярные жгутики). Аэро­бы. Способны к анаэробному дыханию с использованием нитрата в каче­стве акцептора электронов. Некоторые виды - факультативные автотро-фы. Род включает более 70 видов. Они широко распространены в приро­де. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений могут загрязнять фармацевтические препараты, размножаться в растворах ан­тисептиков. На основании гомологии ДНК некоторые виды, относивши­еся к роду Pseudomonas, выделены в род Burkholderia (В.mallei, B.pseudomallei, В.cepacia), род Brevundimonas (B.diminuta) и др.)

Pseudomonas aeruginosa - основной возбудитель гнойно-воспали­тельных процессов, особенно в условиях стационаров. Вызывает общие и местные нагноительные процессы: отиты, пиелиты, циститы, кератиты, менингоэнцефалиты, инфицирует поверхности ран и ожогов. Устойчива к действию антибиотиков. Описаны вспышки токсикоинфекции вслед­ствие употребления пищевых продуктов (мясо, рыба), контаминирован-ных этим микроорганизмом. Образует биопленку на оборудовании систе­мы водоснабжения. Способна разрушать многие химические вещества, в том числе биоциды.



Растет на простых питательных средах в широком диапазоне темпе­ратур (4-42 °С), оптимальная температура 37 °С. Строгий аэроб. На жид­ких средах (пептонная вода, МПБ) образует характерную серовато-сереб­ристую пленку, по мере старения культуры возникает помутнение. На плот­ных средах (МПА, кровяной агар, среды Эндо, Левина, Плоскирова) вид колоний зависит от состава среды. На специальных средах образует сине­вато-зеленоватые пигменты (пиоцианин, флюоресцеин и др.), выделяю­щиеся в питательную среду. Имеются также непигментированные штам­мы. Образует токсины и другие факторы вирулентности.

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia - повсеместно распространен­ный микроорганизм, часто контаминирует растворы для местной анесте­зии, лекарственные препараты, косметические средства. Эпидемиология и этология имеет много общего с таковыми P. aeruqinosa. Подвижная по­лиморфная палочка, по Граму окрашивается биполярно. Температурный оптимум 30 °С. Выделение требует специальных селективных сред. На кровяном огаре с полимиксином образует мутные маслянистые беловато-серые колонии. Возможно образование желтого или зеленоватого нефлю-оресцирующего феназинового пигмента, растворимого в хлороформе.

Семейство Enterobacteriaceae

Семейство Enterobacteriaceae включает более 115 видов, принадле­жащих к 30 родам:. Это прямые палочки 0,3-1,8 мкм. Подвижные (перит-рихи) или неподвижные. Присутствуют повсеместно: в почве, воде, на растениях, у животных. Некоторые из них патогенны и вызывают заболе­вания желудочно- кишечных, дыхательных и мочевыводящих путей, ме­нингиты и раневые инфекции. Около 50 % внутрибольничньгх инфекций вызываются видами этого семейства. Наиболее часто встречаются Escherichia coli, Serratia marcescens и виды родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Shigella.

Pod Escherichia. Прямые палочки 1,1—1,5 г 2,0-6,0 мкм одиночные или в парах. Для многих штаммов характерны капсулы или микрокапсулы.

Виды рода Escherichia различаются по подвижности и биохимичес­кой активности.

Escherichia coli и колиформные бактерии

Е. coli - постоянный обитатель и важный представитель нормаль­ной микробиоты кишечника человека и теплокровных животных. Боль­шая часть штаммов E.coli не считается патогенной, однако вид включает условно-патогенные и патогенные штаммы. Последние различаются по факторам вирулентности, которыми они обладают (энтеротоксигенные, энтеропатогенные, энтерогеморратические и др.)

В 1892 г. Shardinger предложил использовать Е. coli как санитарно-показательный микроорганизм.

По фенотипическим признакам Е. coli имеет много общего с други­ми родами сем. Enterobacteriaceae (Klebsiella, Citrobacter и Enterobacter), поэтому было предложено эту группу бактерий называть колиформными. Этот термин не является таксономическим, но служит рабочим определе­нием группы грамотрицательных факультативно анаэробных палочковид­ных бактерий, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа за 48 ч культивирования при 35 °С.

Некоторые колиформные бактерии способны обитать во внешней среде, поэтому группу санитарно-показательных колиформных бактерий было предложено называть фекальными колиформами. Фекальные коли­формы рассматривают как представителей общих колиформ, которые ра­стут и ферментируют лактозу при повышенной температуре инкубации (термотолерантные колиформы). Эта группа включает в основном Е. coli; однако виды Klebsiella также способны ферментировать лактозу при тем­пературе 44-45 °С. Для дифференциации E.coli и Klebsiella spp. служат специальные методы.

Показатель общего числа колиформ используют в качестве индикато­ра санитарного состояния воды или как основной индикатор санитарного состояния производства в пищевой и фармацевтической промышленности; показатель термотолерантных колиформ - для характеристики санитарно­го состояния воды; E.coli - показатель свежего фекального загрязнения.

Род Citrobacter. Прямые палочки 1 х 2-6 мкм, одиночные и в парах, обычно подвижные. Факультативные анаэробы. Обнаружены в почве, воде и пищевых продуктах, входят в состав нормальной микробиоты кишеч­ника. Штаммы определенных серогрупп вызывают гастроэнтериты и пи­щевые токсикоинфекции, оппортунистические и госпитальные инфекции.

Род Enterobacter. Прямые палочки 0,6-1, х 1,2-3,0 мкм. Подвиж­ные. Оптимальный диапазон температуры 30-37 °С. Вызывает внутри-больничные и опортунистические инфекции.

Род Klebsiella. Прямые палочки 0,3-1,0 х 0,6-6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Неподвижные. Для К. pneumoniae и К. oxytoca характерна массивная полисахаридная капсула, определяющая об­разование крупных мукоидных колоний. Известно более 80 капсульных антигенов, используемых для серотипирования клебсиелл. Широко рас­пространены, встречаются в почве, воде, на фруктах и овощах.

Температурные границы роста 12—43 °С, оптимум рН 7,2.

Вызывают оппортунистические и внутрибольничные инфекции.

К.pneumoniae образует экзотоксин. Является возбудителем бронхо-легочных заболеваний, иногда - менингита; у детей может вызывать сеп­тицемию, циститы и другие заболевания.

К. ozaenae - возбудитель хронического заболевания респираторно­го тракта.

К. rhinoscleromatis вызывает хронический гранулематозный или ат-рофический процессы в слизистой оболочке верхних дыхательных путей.

Род Мorganella. Прямые палочки 0,6-0,7 х 1,0-1,7 мкм. Подвижны (перитрих). Роение отсутствует. Выделяются из фекалий млекопитающих. Вызывают оппортунистические инфекции.

Род Proteus. Прямые палочки 0,4-0,8 х 1-3 мкм. Подвижные (пе­ритрих). У большинства штаммов имеет место роение с периодическими циклами миграции, приводящее к образованию концентрических зон или распространению в виде однородной пленки по влажной поверхности среды. Встречаются в кишечнике позвоночных, в почве, навозе, загряз­ненных водах. Вызывают инфекции мочевых путей, вторичные пораже­ния, часто при ожогах.

Род Providencia. Прямые палочки 0,6-0,8 х 1,5-2,5 мкм, подвиж­ные (перитрих), роение отсутствует. Вызывают желудочно-кишечные рас­стройства, инфекции мочевых путей, вторичные поражения при ранах и ожогах

Род Salmonella. Прямые палочки 0,7-1,5 х 2-5 мкм. Подвижны (пе­ритрих). Встречаются у человека и животных, в пищевых продуктах и в природной среде. Вызывают брюшной тиф, кишечные инфекции, ток-сикоинфекции, септицемию. Образуют эндоксины.

Температурный оптимум 35-37 °С. Диапазон рН 4,1-9,0. Оптимум 7,2-7,4. Рост подавляют или ограничивают высокие концентрации соли и сахара.

Биохимические свойства могут различаться даже в пределах одного серовара.

Род Serratia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 0,9-2 мкм. Обычно под­вижные (перитрих). Некоторые виды образуют розово-красный водоне-растворимый пигмент продигнозин. Распространены повсеместно (вода, почва, растения). S.marcescens вызывает оппортунистические инфекции -септицемию, инфекции мочевых путей, мастит у коров.

Род Shigella. Прямые палочки, неподвижны. По морфологическим признакам не отличаются от других представителей сем. Enterobacteriaceae. Вызывают дизентерию и другие шигеллезы - заболевания, передающие­ся с водой и пищей, распространенные среди приматов, включая челове­ка. По биохимическим признакам шигеллы трудно дифференцировать от Е. coli. На основании гомологиии ДНК их можно отнести к одному виду. S. dysenteriae продуцирует экзотоксин, обладающий выраженным тропиз­мом к нервной системе и слизистой оболочке кишечника. Другие виды шигелл образуют эндотоксины. Вызывают дизентерию.

Род Yersinia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 1-3 мкм, приобретающие иногда сферическую форму. Подвижные (перитрих) или неподвижные (Y. pestis). Подвижность и метаболизм зависит от температуры. Темпера­турные пределы роста - 0-39 °С, для Y.pestis - до 45 °С; оптимум роста 28-30 °С; оптимум рН 6,9-7,2. Широко распространены в природе, пара­зиты животных и человека, йерсиниозы - опасные инфекционные забо­левания.

Грамположительные кокки

У большинства организмов этой группы клетки сферические, иног­да овальные, всегда четко грамположительные, неподвижные.

Род Enterococcus. Род Enterococcus представлен видами, ранее относи­мыми к роду Streptococcus (S.f aecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum и др.)

Клетки сферические или овальные 0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм в парах или (в жидкой среде) коротких цепочках. Факультативные анаэробы. Сбра­живают разнообразные углеводы с образованием лактата. Нуждаются в сложных питательных средах. Каталазоотрицательные. Растут в преде­лах температуры 10—45 °С, оптимальная температура 37 °С. Растут при рН 9,6, концентрации NaCl 6,5 %, желчи - 40 %. Как правило, относятся к серологической группе Lancefield D. Широко распространены в приро­де, обитают в кишечнике позвоночных, иногда вызывают пиогенные ин­фекции.

Все виды и варианты энтерококков признаны санитарно-показатель-ными микроорганизмами и отвечают предъявляемым к ним требованиям. Это постоянные обитатели кишечника несмотря на то, что их количе­ство меньше, чем E.coli; они не способны размножаться во внешней среде (точнее могут размножаться при содержании органических веществ 375 мкг/л и температуре равной 20 °С и выше). Не проявляют выражен­ной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание и не имеют аналогов во внешней среде. Отмирают во внешней среде значи­тельно раньше, чем E.coli, поэтому всегда свидетельствуют о свежем фе­кальном загрязнении. Самым главным достоинством является их устой­чивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем каче­ства режима пастеризации. Энтерококки устойчивы к высоким концент­рациям NaCl (6,5-17 %), что позволяет использовать их при анализе мор­ской воды. Энтерококки устойчивы в диапазоне рН 3-12, что можно ис­пользовать при анализе стоков кислого и щелочного характера.

В настоящее время количественная энтерококкометрия принята меж­дународным стандартом по воде как дополнительный показатель фекаль­ного загрязнения, а при выявлении атипичных E.coli - главным методом выявления фекального загрязнения.

Трудности в индикации энтерококков состоят в необходимости ис­пользовать среды сложного состава и в том, что для их выявления требу­ется больше времени, чем для колиформных бактерий.

Род Staphylococcus. Повсеместно распространенные микроорганиз­мы, чувствительны к нагреванию и действию биоцидов. Поэтому их при­сутствие в помещении свидетельствует о плохом санитарном состоянии.

Стафилококки образуют клетки диаметром 0,5-1,5 мкм, располага­ющиеся в мазках одиночно, парами или гроздьями. Факультативные ана­эробы, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима, растут на средах с 5-10 % NaCl. На плотных средах образуют мутные, круглые колонии желтого, кремо­вого или оранжевого цвета. На жидких средах вызывают помутнение и рыхлый осадок. Разжижают желатин, образуют H2S. Восстанавливают нитраты до нитритов.

Staphylococcus aureus вызывает разнообразные гнойно-септические инфекции и пищевые отравления. S.aureus коагулирует плазму, что явля­ется критерием для идентификации этого вида.

Дрожжи и плесневые грибы

Грибы - многочисленная группа эукариотических микроорганизмов, различающихся по своей морфологии и физиологии. В основном сапрот-рофы, некоторые виды вызывают заболевания человека и животных (ми­козы). Поселяясь на разнообразных продуктах - пищевом и лекарствен­ном сырье, пищевых продуктах, кормах, лекарственных препаратах они вызывают их порчу и могут выделять в среду опасные микотоксины. Кон­такт с материалом, инфицированном грибами, может привести к разви­тию заболеваний, в том числе аллергических. Подробно материал изло­жен в главе 2.

 

16.3. Принципы микробиологического контроля НЛС

 

Контроль осуществляют на всех предприятиях, выпускающих ле­карственные препараты, с целью оценки качества готовой продукции по показателю «микробиологическая чистота» и соответствия его установ­ленным требованиям. Исследования проводят в микробиологических ла­бораториях, аккредитованных в соответствии с ОСТ 42-503—95.

Схема анализа должна отвечать следующим требованиям:

■ предельная краткость по времени и числу использованных тестов;

■ использование методов, обеспечивающих точность количественного

подсчета и достоверную идентификацию нормируемых микроорга­низмов.

Микробиологический контроль лекарственных средств отличается от традиционного контроля пищевых продуктов или патологического материала. Отличие состоит в использовании сред обогащения при ана­лизе лекарственных препаратов на возможное присутствие условно-пато­генных микроорганизмов, которые могут находиться в препарате в не­большом количестве.

В таком случае прямой посев контаминированного препарата на плотные дифференциально-диагностические среды, как это делают в санитарной микробиологии при анализе продуктов, в большинстве случа­ев не приводит к обнаружению искомой группы бактерий за исключени­ем случаев высокой контаминации.

В средах обогащения (селективных) существуют условия для пре­имущественного роста и размножения определенных условно-патоген­ных микроорганизмов, иногда за счет добавления ингибиторов роста других бактерий. В благоприятных условиях начинает преобладать ис­комый вид (группа) микроорганизмов, хотя посторонние микроорганиз­мы могут присутствовать в незначительном количестве. Далее микро­организмы идентифицируют на основании их морфологических и био­химических свойств. Еще одной особенностью контроля лекарственных препаратов является определение их антимикробной активности и уст­ранение ее перед проведением анализа. Без этого возможно выявление только устойчивых к данному препарату микроорганизмов, что искажа­ет реально существующую ситуацию и не позволяет получать достовер­ные результаты.

Факторы, обеспечивающие достоверность результатов анализа Принципиальное значение имеет масса образца, т. е. количество препарата, взятого для анализа. Чем больше масса образца, тем выше ста­тистическая достоверность вывода об отсутствии патогенных микроор­ганизмов. Например, при массе образца для анализа 1-5 г предваритель­но контаминированного препарата условно-патогенные микроорганизмы удавалось выявить только при нескольких повторных анализах. При уве­личении массы образца до 10 г положительный ответ удавалось получить с первого раза.

Вторым фактором, обеспечивающим достоверность ответа, являет­ся качество питательных сред. Питательные среды должны быть изго­товлены в строгом соответствии с указаниями ГФ, из компонентов, отве­чающих по качеству требованиям ГОСТ. Они должны храниться в усло­виях, исключающих их высыхание или увлажнение, и проверены на рос­товые свойства и стерильность. Под ростовыми свойствами понимают способность питательной среды обеспечивать эффективный рост специ­альных штаммов тест-микроорганизмов. На ростовые свойства, проверя­ют каждую новую партию среды. Стерильность контролируют путем тер-мостатирования образца приготовленной среды после ее стерилизации (отбирают 5 % от всего количества).

Третий фактор, влияющий на достоверность ответа, это отсутствие антимикробной активности препарата. Чтобы исключить попадание в объекты анализа посторонних микроорганизмов, анализ проводят в стро­го асептичных условиях в специальном помещении, полностью изоли­рованном от процесса производства.

Схема анализа НЛС, не обладающих антимикроб­ным действием

В соответствии с требованиями НТД в НЛС определяют общее чис­ло бактерий и грибов, а также возможное присутствие условно-патоген­ных микроорганизмов. Для этого используют 15 различных питательных сред, каждая из которых имеет определенный номер (табл. 28). Схема и методы анализа являются одинаковыми для всех видов НЛС, независи­мо от их лекарственной формы (твердой, мягкой, жидкой). Схема анализа включает следующие этапы:

• обогащение культур;

• первичная дифференциация (разделение по группам) на диффе­ренциально-диагностических средах;

• выделение «чистых» культур микроорганизмов;

• изучение морфологических и биохимических свойств выделенных культур;

• заключение о присутствии (отсутствии) конкретных культур на ос­новании совокупности признаков.

Общий принцип микробиологического контроля состоит в анализе так называемой выборочной пробы и в перенесении результатов контро­ля на всю серию или партию препарата.

Выборочная проба -это образцы, отбираемые из всей массы иссле­дуемого объекта при соблюдении принципа случайности выборки. Сери­ей (ши партией) препарата называют определенное количество продук­та, изготавливаемого в условиях, которые считаются постоянными. Ос­новным требованием к серии (партии) является ее однородность по пока­зателям качества. Для анализа ГЛС от каждой серии (не зависимо от объе­ма) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из равных разовых проб, взятых как минимум из 10 разных упаковок. Всего для про­ведения одного анализа по схеме используют 30 г лекарственного сред­ства: 10 г (мл) - для определения общего количества бактерий и грибов -мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов (МАФАМ), 10 г (мл) - для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (или Escherichia coli и Salmonella spp.), 10г(мл)-для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. В том слу­чае, когда необходимо подтвердить результат, проводят повторное испы­тание по конкретному разделу схемы анализа, используя при этом обра­зец 10 г (мл) из оставшегося от средней пробы.

Таблица 28

Перечень и назначение питательных сред, использующихся в схеме анализа нестерильных лекарственных средств

 

Название и номер среды по схеме Назначение, особенность компонентного состава Учитываемый признак, его проявление
Среда № 1 Количественное определение бактерий (МАФАМ). Макроморфология и подсчет числа колоний.
Среда № 2 Определение количества грибов и дрожжей. Макроморфология и подсчет числа колоний.
Накопительная среда № 3 Среда создает условия для преимущественного роста Г" палочек (при этом рост Г* бактерий подавлен внесенным в среду малахитовым зеленым). Изменение цвета среды, признаки бактериального роста.
Дифференциал ьно- диагностическа я Среда № 4 (Эндо) Идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae, Escherichia coli. Способность ферментировать лактозу, появление красных (бледно-розовых) колоний с металлическим блеском (без блеска); рост микроорганизмов сопровождается изменением цвета среды в ярко-малиновый.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 5 (висмутсульфит агар) Идентификация бактерий Enterobacteriaceae, Salmonella spp. Черные (коричневые) колонии.
Накопительная среда № 8 Накопление Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus. Изменение цвета среды, признаки бактериального роста.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 9 (с глицерином) Выявление пигмента пиоцианина у Pseudomonas aeruginosa. Изменение цвета среды с серовато-желтоватого на голубовато-зеленоватый (серо-зеленый); колонии серые, коричневые.
Дифференциал ьно диагностическая среда № 10 (с маннитом) Выявление стафилококков. Появление желтых, выпуклых колоний, окруженных желтыми зонами вследствие ферментации маннита.


При проведении испытания мембранным методом от каждой серии препарата отбирают среднюю пробу не менее 6 г (мл), если нет другого указания в частных Фармакопейных статьях. В зависимости от физичес­ких свойств лекарственной формы образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии:

твердые лекарственные формы, которые плохо растворяются, пред­варительно измельчают с использованием оборудования, исключающего дополнительное загрязнение микроорганизмами и суспензируют в фос­фатном буферном растворе рН 7,0 (или соответствующей жидкой пита­тельной среде), соблюдая соотношение объем препарата: объем буферно­го раствора 1:20;

жидкие лекарственные формы, а также твердые формы, растворяю­щиеся в буфере, готовят в виде растворов 1:10;

мягкие лекарственные формы, нерастворимые в воде, предваритель­но эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 с добавлением эмульгатора (например, твина - 80).

При подготовке к анализу используют стеклянные бусы при меха­ническом встряхивании и нагревании пробы до температуры не более 45 °С. Приготовленные образцы используют для определения общего ко­личества МАФАМ и условно-патогенных микроорганизмов, нормируе­мых в препаратах разных категорий.

 

Количественное определение микроорганизмов

Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри. Приготовленный раствор, суспензию или эмульсию препарата вносят по 1 мл в каждую из 2-х пробирок с 4 мл расплавленной и ох­лажденной до 45-50 °С среды № 1. Быстро перемешивают содержи­мое пробирки и переносят в чашку, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды № 1. Быстрым покачиванием чашки равномерно распределяют верхний слой агара до его застывания. Чашки инкуби­руют 5 суток при 30-35 °С.

При таком способе посева микроорганизмы, содержащиеся в ана­лизируемом образце, распределяются в тонком слое на поверхности сре­ды, где имеются благоприятные условия для роста аэробных и факульта­тивно-анаэробных бактерий. Слой питательной среды, предварительно внесенной в чашку, обеспечивает диффузию питательных веществ для прорастания колоний микроорганизмов.

После инкубирования посевов через 2 сут и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, нахо­дят среднее значение и умножают на показатель разведения для определе­ния числа МАФАМ в 1 г (мл) образца.

Для получения достоверных результатов учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 колоний. Если при посеве разведения препарата 1:10 на чашках нет роста, делают заключение о том, что в 1 г препарата содержатся менее 10 бактерий. Если число колоний превышает 300, делают ряд последовательных разведений образца.

Для определения общего числа грибов препарат засевают на среду № 2, используя двухслойный агаровый метод, как описано выше.

 

 
 

 

Количественное определение энтеробактерий за исключением Escherichia coli и Salmonella spp.

10 г или 10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды №11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32,5±2,5 °С в тече­ние, как правило, двух часов, но не более пяти. В случае, если лекарствен­ное средство - суппозитории или растворы в маслах, в среду № 11 добав­ляют стерильный твин-80 в количестве не более 5 % и стеклянные бусы для эмульгирования.

Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, исполь­зуя для этого среду № 3. В три пробирки с 10 мл среды № 3 вносят 1 мл гомогената в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и 1 мл разведения

1:100 в третью, то есть соответственно 0,1 г, 0,01 г, 0,001 г образца. Посе­вы инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на плотную среду № 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамот-рицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по табл. 29.

Таблица 29

Количественное определение энтеробактерий

 

Количество испытуемого образца Вероятное количество бактерий в 1 г (мл)
0,1 г (мл) 0,01 г (мл) 0,001 г (мл)    
1 мл гомогената 1 мл гомогената в разведении 1:10 1 мл гомогената в разведении 1:100  
+ + + Более 1000  
+ + - От 100 до 1000
+   - От 10 до 100
- - - Менее 10

Обозначения: + наличие роста бактерий; - отсутствие роста бактерий

Количество клеток E.coli в 1 мг (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также данной таблицей.

Испытание на наличие Escherichia coli и Salmonella spp.

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл пита­тельной среды № 11 (лактозный бульон). В случае если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубиру­ют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 2-5 ч 10 мл среды № 11 пере­носят в 100 мл среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32,5± 2,5) °С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде № 3 (сре­да прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испы­тания продолжают.

Испытание на Е. coli

Со среды № 3 делают пересев петлей на среду № 4 (агар Эндо) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 18-24 ч. На среде № 4 Е. coli образуют, как правило, характерные малиновые колонии с ме­таллическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к Е. coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду № 1 и инкубируют при температуре (32,5±2,5)°С в течение 18-24 ч. Из про­бирок с чистой культурой делают пересевы на среды № 14 (агар Симмонса) в № 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на цитохромокси-дазу. Через 18-24 ч инкубации при (32,5±2,5) °С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах № 14 и № 15. Утилизацию цитрата уста­навливают по изменению цвета среды № 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды № 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую-щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизи­рующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

Испытание на виды Salmonella

1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл среды № 12 (селенитовая среда) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 16-18 час. Делают пересев петлей на среду № 5 (висмут-суль­фит агар) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 14-18 ч. На среде № 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные коло­нии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлеж­ность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на среду № 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру со среды № 1. Че­рез 18-24 ч инкубации при температуре (32,5±2,5) °С отмечают измене­ние цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной сре­ды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода -типичном признаке видов Salmonella.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую-щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не фермен­тирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

Образец препарата вносят в среду № 8 (1:10) и инкубируют 24-48 ч при температуре 30-35°С. После инкубирования пересевают на среды

№ 9 и № 10 в чашки Петри. При отсутствии роста на средах № 9 и № 10 после их инкубирования 24-48 ч делают заключение об отсутствии этих микроорганизмов в препарате.

При наличии на среде № 9 подозрительных на Pseudomonas aeruginosa колоний зеленоватых или серовато-зеленоватых, прозрачных, плоских, с изменением цвета среды в голубовато-зеленоватый и обладаю­щих специфическим запахом, проводят микроскопирование. При обна­ружении грамотрицательных палочек проверяют наличие цитохромокси-дазы.

Если в препарате обнаружены грамотрицательные неспорообразу-ющие палочки, дающие положительную реакцию на цитохромоксидазу и образующие сине-зеленый пигмент, значит в препарате присутствуют бактерии Pseudomonas aeruginosa и препарат к применению не пригоден.

При наличии на среде № 10 золотисто-желтых колоний, образован­ных грамположительными кокками и окруженных желтыми зонами, де­лают вывод о ферментации маннита. Чистую культуру стафилококка про­веряют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Если в препарате обнаружены грамположительные кокки, фермен­тирующие маннит и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, значит препарат контаминирован Staphylococcus aureus и к применению не пригоден.

Методы выявления антимикробной активности лекарственных препаратов

Определение антимикробной активности проводят однократно для всей номенклатуры препаратов, выпускаемых на конкретном производ­стве. Некоторые лекарственные препараты обладают выраженным анти­микробным действием в связи с их целевым назначением (для лечения инфекционных заболеваний). К ним относят: антибиотики, препараты, в состав которых введены антибиотики и химиотерапевтические препа­раты: сульфаниламиды, нитрофурановые, производные 8-оксихинолина, соли тяжелых металлов, производные фторхинолона и некоторые другие. Кроме того существует ряд лекарственных средств, способных оказывать неспецифическое антимикробное действие: кислоты (например, ацетил­салициловая кислота), щелочи, спирты, окислители, препараты, содержа­щие серу, фитонциды, эфирные масла, витамины, анальгетики и др.

В основе метода определения антимикробного действия лежит срав­нение интенсивности роста тест-микроорганизмов в присутствии и в от­сутствие препарата. В качестве тест-микроорганизмов используют опре­деленные штаммы Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans и Aspergillus niger. Заключение об отсутствии антимикробного действия делают при наблюдении одинаковой интенсивности роста всех культур в опытном и контрольном посевах.

Способы устранения антимикробного действия ле­карственных средств

Для НЛС рекомендованы такие методы:

увеличение рабочего разбавления препарата (за счет большого объе­ма фосфатного буферного раствора);

добавление специфических инактиваторов (например, пеницилли-назы для b-лактамных антибиотиков) или веществ, замещающих антиме­таболит (например, парааминобензойной кислоты для сульфаниламидов);

использование неспецифических инактиваторов-нейтрализаторов, особенно для препаратов с консервантами, например, 0,3-0,4 % раствор твина-80 и твина-20; 0,1-0,5 % раствор соевого лецитина, гистидина, ко­торые предварительно вносят в питательную среду.

Если все перечисленные методы неэффективны, а лекарственное вещество растворимо, то используют метод мембранной фильтрации.

 

4. Контроль стерильности лекарственных препаратов

 

Целью испытания на стерильность является подтверждение полно­го отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в объекте. В некото­рых случаях, например, в производстве вакцин проводят испытания на полное отсутствие вирусов в объекте.

Анализу подлежит каждая партия препарата. За партию (серию) при­нимают количество препарата, для которого вероятность нарушения или недостижения стерильности одинакова. Достоверность испытания на сте­рильность зависит от нескольких факторов:

объема (массы) образца для анализа;

состава и качества питательных сред;

используемого метода исследования;

соблюдения асептичных условий проведения анализа.

 

Объем образца.

В связи с тем, что метод испытания является разрушающим, отби­рать на анализ большое количество образцов невыгодно, вместе с тем есть риск получить неадекватный ответ, если проводить испытание на малом числе образцов из серий большого объема. Размер выборочной пробы устанавливают в зависимости от вида стерилизации и числа единиц в се­рии. Если лекарственное средство стерилизуют паром под давлением 0,11±0,02 МПа и температуре 121 °С, то образец состоит из 10 единиц, независимо от числа образцов в серии. При других видах стерилизации минимальное количество образцов определяют по формуле:

n = 0,4N

 

где: п - число единиц для анализа; N-число единиц в исследуемой серии, при этом п должно быть не менее 3 и не более 40.

Качество питательных сред. Питательные среды должны быть максимально пригодны для контроля микроорганизмов, т. е. учитывать различные потребности, обеспечивающие прорастание клеток, хотя изве­стно, что универсальной среды практически быть не может. По современ­ной НТД применяют жидкие питательные среды тиогликолевую и Сабу-ро, а для иммунобиологических - только тиогликолевую. Эта среда обла­дает некоторыми преимуществами: снижает окислительно-восстанови­тельный потенциал и способствует росту анаэробных микроорганизмов, обеспечивает рост грибов, нейтрализует антимикробное действие неко­торых консервантов.

Контроль качества питательных сред проводят путем проверки сте­рильности и ростовых свойств для доказательства отсутствия торможе­ния роста. В качестве тест-микроорганизмов для тиогликолевой среды используют определенные штаммы Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Для проверки ростовых свойств среды Сабуро используют Candida albicans.

Для контроля стерильности проверяют 5 % от партии приготовлен­ной питательной среды путем выдерживания в термостате при температу­ре 30-35 °С 48 ч для тиогликолевой и 20-25 °С 70-72 ч для среды Сабуро.

Метод анализа. Контроль стерильности можно проводить двумя методами: прямым посевом образца в питательные среды и мембранной фильтрацией. При прямом посеве испытуемый препарат предварительно растворяют или суспендируют и вносят в среду в количестве, зависящем от объема содержимого одной единицы: если в ампуле 1 мл, то весь объем, для ампул объема \-\ мл засевают 1 мл, если объем составляет 5-19 мл -2 мл, для объема 20-100 мл - 2-4 мл, а при анализе содержимого флако­нов объемом более 100 мл предпочтительным является метод мембран­ной фильтрации. Объем питательной среды должен в 10 раз превышать объем образца для посева.

Посевы втиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35 °С, а в среде Сабуро - 20—25 °С. Продолжительность инкубации 14 суток.

Интерпретация результатов. Посевы просматривают ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оце­нивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других при­знаков микробного роста. Выявленный рост подтверждают микроскопи­ей мазков, окрашенных по Граму. Препарат считают стерильным при от­сутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в од­ной пробирке (колбе) испытание проводят повторно на таком же количе­стве образцов. При отсутствии роста испытуемый препарат считают удов­летворяющим требованиям. В случае роста микроорганизмов при повто­ром посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, обнаружен­ными в первичном посеве испытуемый препарат считают нестерильным. Если выявлена другая морфологическая группа, то испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста в третьем испытании препарат считают стерильным. Если хотя бы в одной пробирке обнаружен рост, испытуемый препарат считают нестерильным.

Испытание на стерильность методом мембранной фильтрации. Испытание проводят с использованием открытой или замкнутой систе­мы. При испытании в открытой системе используют фильтродержатели и мембраны диаметром 47 мм. Метод основан на фильтрации образца че­рез мембрану с порами 0,45 мкм со скоростью, предотвращающей про­скок микроорганизмов. При испытании препаратов с антимикробной ак­тивностью после фильтрации мембрану тщательно промывают раство­ром, объем которого определен заранее. Предварительно эксперименталь­но определяют тип и объем промывной жидкости, необходимой для пол­ного удаления антимикробного вещества. Полноту отмывки мембраны можно проверить биологически по тест-микроорганизмам или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Мембрану после отмы­вания растворяют в 2 мл ацетона и оценивают присутствие антимикроб­ного вещества.

В анализах на стерильность целесообразно использовать мембра­ны, выполненные из инертных полимерных материалов, не взаимодей­ствующих с антимикробными агентами. Для предотвращения подтекания фильтруемой жидкости под мембрану, применяют мембраны с гидрофоб­ным краем. После фильтрации мембрану стерильными ножницами разре­зают пополам и одну часть помещают в тиогликолевую среду, а другую в среду Сабуро с последующим термостатированием в течение 7 суток при ранее указанных температурах. Одновременно проводится контроль на асептичность посева. Используют такую же стерильную установку, через которую пропускают заведомо стерильную жидкость и производят посев. Параллельно ставят контроль на отсутствие следов антимикроб­ного вещества. После внесения мембраны во флакон со средой добавля­ют суспензию, содержащую приблизительно 100 клеток тест-микроорга­низмов. В случае их прорастания делают вывод об устранении антимик­робной активности.

Испытание на стерильность в закрытой системе «Стеритест» про­водят для препаратов с выраженным антимикробным действием или име­ющим объем более 100 мл (инфузионных растворов). Преимуществами метода мембранной фильтрации являются:

1) высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возмож­ности концентрирования или удержания на мембране даже единич­ных клеток при пропускании большого объема препарата;

2) высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при уст­ранении антимикробной активности;

3) сокращенные сроки испытания.

К ограничениям метода мембранной фильтрации можно отнести необходимость проведения испытания в строго асептичных условиях (при использовании открытой системы), необходимость использовать эффек­тивное оборудование, мембранные материалы, а также повышенные тре­бования к квалификации персонала.

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
| Микробиологическая чистота готовых лекарственных средств

Дата добавления: 2015-05-26; Просмотров: 1654; Нарушение авторских прав?;


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



ПОИСК ПО САЙТУ:


Читайте также:



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2017) год. Не является автором материалов, а предоставляет студентам возможность бесплатного обучения и использования! Последнее добавление ip: 54.80.77.124
Генерация страницы за: 0.298 сек.