Микробиологическая чистота готовых лекарственных средств

Табл.27.

Категория	Препараты	Рекомендуемые требования
	Лекарственные препараты, к которым предъявляется требование «стерильность»	Препараты должны быть стериль­ными
	• Для применения местно, наружно, интравагиналь-но • Для введения в полости уха, носа • Для введения в дыха­тельные пути • Трансдермальные пла­стыри За исключением тех лекар­ственных препаратов, ко­торые должны быть сте­рильными	• Общее число аэробных бактерий и грибов суммарно - не более 10^2в 1 г или в 1 мл, или на 1 пла­стырь (включая клейкую сторону и основу) • Отсутствие энтеробактерий и некоторых других грамотрица-тельных бактерий на 1 пластырь (включая клейкую сторону и ос­нову) • Не более 10^1 энтеробактерий и некоторых других грамотрица-тельных бактерий в 1 г или 1 мл для других препаратов • Отсутствие Pseudomonas aerugi­nosa в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу)

В последующих разделах этой главы будут рассмотрены морфолого-биохимические особенности микроорганизмов (в порядке их перечис­ления в Определителе бактерий Берджи), содержание которых регламен­тировано для продукции фармацевтической промышленности, в связи с существующими методами их выделения и идентификации, а также их значение в паталогии человека.

Грамотрицательные аэробные (микроаэрофильные палочки)

Род Pseudomonas. Прямые или слегка изогнутые, но не спираль­ные палочки 0,5-1,0 х 1,5-5,0 мкм. Подвижны (полярные жгутики). Аэро­бы. Способны к анаэробному дыханию с использованием нитрата в каче­стве акцептора электронов. Некоторые виды - факультативные автотро-фы. Род включает более 70 видов. Они широко распространены в приро­де. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений могут загрязнять фармацевтические препараты, размножаться в растворах ан­тисептиков. На основании гомологии ДНК некоторые виды, относивши­еся к роду Pseudomonas, выделены в род Burkholderia (В.mallei, B.pseudomallei, В.cepacia), род Brevundimonas (B.diminuta) и др.)

Pseudomonas aeruginosa - основной возбудитель гнойно-воспали­тельных процессов, особенно в условиях стационаров. Вызывает общие и местные нагноительные процессы: отиты, пиелиты, циститы, кератиты, менингоэнцефалиты, инфицирует поверхности ран и ожогов. Устойчива к действию антибиотиков. Описаны вспышки токсикоинфекции вслед­ствие употребления пищевых продуктов (мясо, рыба), контаминирован-ных этим микроорганизмом. Образует биопленку на оборудовании систе­мы водоснабжения. Способна разрушать многие химические вещества, в том числе биоциды.

Растет на простых питательных средах в широком диапазоне темпе­ратур (4-42 °С), оптимальная температура 37 °С. Строгий аэроб. На жид­ких средах (пептонная вода, МПБ) образует характерную серовато-сереб­ристую пленку, по мере старения культуры возникает помутнение. На плот­ных средах (МПА, кровяной агар, среды Эндо, Левина, Плоскирова) вид колоний зависит от состава среды. На специальных средах образует сине­вато-зеленоватые пигменты (пиоцианин, флюоресцеин и др.), выделяю­щиеся в питательную среду. Имеются также непигментированные штам­мы. Образует токсины и другие факторы вирулентности.

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia - повсеместно распространен­ный микроорганизм, часто контаминирует растворы для местной анесте­зии, лекарственные препараты, косметические средства. Эпидемиология и этология имеет много общего с таковыми P. aeruqinosa. Подвижная по­лиморфная палочка, по Граму окрашивается биполярно. Температурный оптимум 30 °С. Выделение требует специальных селективных сред. На кровяном огаре с полимиксином образует мутные маслянистые беловато-серые колонии. Возможно образование желтого или зеленоватого нефлю-оресцирующего феназинового пигмента, растворимого в хлороформе.

Семейство Enterobacteriaceae

Семейство Enterobacteriaceae включает более 115 видов, принадле­жащих к 30 родам:. Это прямые палочки 0,3-1,8 мкм. Подвижные (перит-рихи) или неподвижные. Присутствуют повсеместно: в почве, воде, на растениях, у животных. Некоторые из них патогенны и вызывают заболе­вания желудочно- кишечных, дыхательных и мочевыводящих путей, ме­нингиты и раневые инфекции. Около 50 % внутрибольничньгх инфекций вызываются видами этого семейства. Наиболее часто встречаются Escherichia coli, Serratia marcescens и виды родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Shigella.

Pod Escherichia. Прямые палочки 1,1—1,5 г 2,0-6,0 мкм одиночные или в парах. Для многих штаммов характерны капсулы или микрокапсулы.

Виды рода Escherichia различаются по подвижности и биохимичес­кой активности.

Escherichia coli и колиформные бактерии

Е. coli - постоянный обитатель и важный представитель нормаль­ной микробиоты кишечника человека и теплокровных животных. Боль­шая часть штаммов E.coli не считается патогенной, однако вид включает условно-патогенные и патогенные штаммы. Последние различаются по факторам вирулентности, которыми они обладают (энтеротоксигенные, энтеропатогенные, энтерогеморратические и др.)

В 1892 г. Shardinger предложил использовать Е. coli как санитарно-показательный микроорганизм.

По фенотипическим признакам Е. coli имеет много общего с други­ми родами сем. Enterobacteriaceae (Klebsiella, Citrobacter и Enterobacter), поэтому было предложено эту группу бактерий называть колиформными. Этот термин не является таксономическим, но служит рабочим определе­нием группы грамотрицательных факультативно анаэробных палочковид­ных бактерий, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа за 48 ч культивирования при 35 °С.

Некоторые колиформные бактерии способны обитать во внешней среде, поэтому группу санитарно-показательных колиформных бактерий было предложено называть фекальными колиформами. Фекальные коли­формы рассматривают как представителей общих колиформ, которые ра­стут и ферментируют лактозу при повышенной температуре инкубации (термотолерантные колиформы). Эта группа включает в основном Е. coli; однако виды Klebsiella также способны ферментировать лактозу при тем­пературе 44-45 °С. Для дифференциации E.coli и Klebsiella spp. служат специальные методы.

Показатель общего числа колиформ используют в качестве индикато­ра санитарного состояния воды или как основной индикатор санитарного состояния производства в пищевой и фармацевтической промышленности; показатель термотолерантных колиформ - для характеристики санитарно­го состояния воды; E.coli - показатель свежего фекального загрязнения.

Род Citrobacter. Прямые палочки 1 х 2-6 мкм, одиночные и в парах, обычно подвижные. Факультативные анаэробы. Обнаружены в почве, воде и пищевых продуктах, входят в состав нормальной микробиоты кишеч­ника. Штаммы определенных серогрупп вызывают гастроэнтериты и пи­щевые токсикоинфекции, оппортунистические и госпитальные инфекции.

Род Enterobacter. Прямые палочки 0,6-1, х 1,2-3,0 мкм. Подвиж­ные. Оптимальный диапазон температуры 30-37 °С. Вызывает внутри-больничные и опортунистические инфекции.

Род Klebsiella. Прямые палочки 0,3-1,0 х 0,6-6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Неподвижные. Для К. pneumoniae и К. oxytoca характерна массивная полисахаридная капсула, определяющая об­разование крупных мукоидных колоний. Известно более 80 капсульных антигенов, используемых для серотипирования клебсиелл. Широко рас­пространены, встречаются в почве, воде, на фруктах и овощах.

Температурные границы роста 12—43 °С, оптимум рН 7,2.

Вызывают оппортунистические и внутрибольничные инфекции.

К.pneumoniae образует экзотоксин. Является возбудителем бронхо-легочных заболеваний, иногда - менингита; у детей может вызывать сеп­тицемию, циститы и другие заболевания.

К. ozaenae - возбудитель хронического заболевания респираторно­го тракта.

К. rhinoscleromatis вызывает хронический гранулематозный или ат-рофический процессы в слизистой оболочке верхних дыхательных путей.

Род Мorganella. Прямые палочки 0,6-0,7 х 1,0-1,7 мкм. Подвижны (перитрих). Роение отсутствует. Выделяются из фекалий млекопитающих. Вызывают оппортунистические инфекции.

Род Proteus. Прямые палочки 0,4-0,8 х 1-3 мкм. Подвижные (пе­ритрих). У большинства штаммов имеет место роение с периодическими циклами миграции, приводящее к образованию концентрических зон или распространению в виде однородной пленки по влажной поверхности среды. Встречаются в кишечнике позвоночных, в почве, навозе, загряз­ненных водах. Вызывают инфекции мочевых путей, вторичные пораже­ния, часто при ожогах.

Род Providencia. Прямые палочки 0,6-0,8 х 1,5-2,5 мкм, подвиж­ные (перитрих), роение отсутствует. Вызывают желудочно-кишечные рас­стройства, инфекции мочевых путей, вторичные поражения при ранах и ожогах

Род Salmonella. Прямые палочки 0,7-1,5 х 2-5 мкм. Подвижны (пе­ритрих). Встречаются у человека и животных, в пищевых продуктах и в природной среде. Вызывают брюшной тиф, кишечные инфекции, ток-сикоинфекции, септицемию. Образуют эндоксины.

Температурный оптимум 35-37 °С. Диапазон рН 4,1-9,0. Оптимум 7,2-7,4. Рост подавляют или ограничивают высокие концентрации соли и сахара.

Биохимические свойства могут различаться даже в пределах одного серовара.

Род Serratia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 0,9-2 мкм. Обычно под­вижные (перитрих). Некоторые виды образуют розово-красный водоне-растворимый пигмент продигнозин. Распространены повсеместно (вода, почва, растения). S.marcescens вызывает оппортунистические инфекции -септицемию, инфекции мочевых путей, мастит у коров.

Род Shigella. Прямые палочки, неподвижны. По морфологическим признакам не отличаются от других представителей сем. Enterobacteriaceae. Вызывают дизентерию и другие шигеллезы - заболевания, передающие­ся с водой и пищей, распространенные среди приматов, включая челове­ка. По биохимическим признакам шигеллы трудно дифференцировать от Е. coli. На основании гомологиии ДНК их можно отнести к одному виду. S. dysenteriae продуцирует экзотоксин, обладающий выраженным тропиз­мом к нервной системе и слизистой оболочке кишечника. Другие виды шигелл образуют эндотоксины. Вызывают дизентерию.

Род Yersinia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 1-3 мкм, приобретающие иногда сферическую форму. Подвижные (перитрих) или неподвижные (Y. pestis). Подвижность и метаболизм зависит от температуры. Темпера­турные пределы роста - 0-39 °С, для Y.pestis - до 45 °С; оптимум роста 28-30 °С; оптимум рН 6,9-7,2. Широко распространены в природе, пара­зиты животных и человека, йерсиниозы - опасные инфекционные забо­левания.

Грамположительные кокки

У большинства организмов этой группы клетки сферические, иног­да овальные, всегда четко грамположительные, неподвижные.

Род Enterococcus. Род Enterococcus представлен видами, ранее относи­мыми к роду Streptococcus (S.f aecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum и др.)

Клетки сферические или овальные 0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм в парах или (в жидкой среде) коротких цепочках. Факультативные анаэробы. Сбра­живают разнообразные углеводы с образованием лактата. Нуждаются в сложных питательных средах. Каталазоотрицательные. Растут в преде­лах температуры 10—45 °С, оптимальная температура 37 °С. Растут при рН 9,6, концентрации NaCl 6,5 %, желчи - 40 %. Как правило, относятся к серологической группе Lancefield D. Широко распространены в приро­де, обитают в кишечнике позвоночных, иногда вызывают пиогенные ин­фекции.

Все виды и варианты энтерококков признаны санитарно-показатель-ными микроорганизмами и отвечают предъявляемым к ним требованиям. Это постоянные обитатели кишечника несмотря на то, что их количе­ство меньше, чем E.coli; они не способны размножаться во внешней среде (точнее могут размножаться при содержании органических веществ 375 мкг/л и температуре равной 20 °С и выше). Не проявляют выражен­ной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание и не имеют аналогов во внешней среде. Отмирают во внешней среде значи­тельно раньше, чем E.coli, поэтому всегда свидетельствуют о свежем фе­кальном загрязнении. Самым главным достоинством является их устой­чивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем каче­ства режима пастеризации. Энтерококки устойчивы к высоким концент­рациям NaCl (6,5-17 %), что позволяет использовать их при анализе мор­ской воды. Энтерококки устойчивы в диапазоне рН 3-12, что можно ис­пользовать при анализе стоков кислого и щелочного характера.

В настоящее время количественная энтерококкометрия принята меж­дународным стандартом по воде как дополнительный показатель фекаль­ного загрязнения, а при выявлении атипичных E.coli - главным методом выявления фекального загрязнения.

Трудности в индикации энтерококков состоят в необходимости ис­пользовать среды сложного состава и в том, что для их выявления требу­ется больше времени, чем для колиформных бактерий.

Род Staphylococcus. Повсеместно распространенные микроорганиз­мы, чувствительны к нагреванию и действию биоцидов. Поэтому их при­сутствие в помещении свидетельствует о плохом санитарном состоянии.

Стафилококки образуют клетки диаметром 0,5-1,5 мкм, располага­ющиеся в мазках одиночно, парами или гроздьями. Факультативные ана­эробы, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима, растут на средах с 5-10 % NaCl. На плотных средах образуют мутные, круглые колонии желтого, кремо­вого или оранжевого цвета. На жидких средах вызывают помутнение и рыхлый осадок. Разжижают желатин, образуют H₂S. Восстанавливают нитраты до нитритов.

Staphylococcus aureus вызывает разнообразные гнойно-септические инфекции и пищевые отравления. S.aureus коагулирует плазму, что явля­ется критерием для идентификации этого вида.

Дрожжи и плесневые грибы

Грибы - многочисленная группа эукариотических микроорганизмов, различающихся по своей морфологии и физиологии. В основном сапрот-рофы, некоторые виды вызывают заболевания человека и животных (ми­козы). Поселяясь на разнообразных продуктах - пищевом и лекарствен­ном сырье, пищевых продуктах, кормах, лекарственных препаратах они вызывают их порчу и могут выделять в среду опасные микотоксины. Кон­такт с материалом, инфицированном грибами, может привести к разви­тию заболеваний, в том числе аллергических. Подробно материал изло­жен в главе 2.

16.3. Принципы микробиологического контроля НЛС

Контроль осуществляют на всех предприятиях, выпускающих ле­карственные препараты, с целью оценки качества готовой продукции по показателю «микробиологическая чистота» и соответствия его установ­ленным требованиям. Исследования проводят в микробиологических ла­бораториях, аккредитованных в соответствии с ОСТ 42-503—95.

Схема анализа должна отвечать следующим требованиям:

■ предельная краткость по времени и числу использованных тестов;

■ использование методов, обеспечивающих точность количественного

подсчета и достоверную идентификацию нормируемых микроорга­низмов.

Микробиологический контроль лекарственных средств отличается от традиционного контроля пищевых продуктов или патологического материала. Отличие состоит в использовании сред обогащения при ана­лизе лекарственных препаратов на возможное присутствие условно-пато­генных микроорганизмов, которые могут находиться в препарате в не­большом количестве.

В таком случае прямой посев контаминированного препарата на плотные дифференциально-диагностические среды, как это делают в санитарной микробиологии при анализе продуктов, в большинстве случа­ев не приводит к обнаружению искомой группы бактерий за исключени­ем случаев высокой контаминации.

В средах обогащения (селективных) существуют условия для пре­имущественного роста и размножения определенных условно-патоген­ных микроорганизмов, иногда за счет добавления ингибиторов роста других бактерий. В благоприятных условиях начинает преобладать ис­комый вид (группа) микроорганизмов, хотя посторонние микроорганиз­мы могут присутствовать в незначительном количестве. Далее микро­организмы идентифицируют на основании их морфологических и био­химических свойств. Еще одной особенностью контроля лекарственных препаратов является определение их антимикробной активности и уст­ранение ее перед проведением анализа. Без этого возможно выявление только устойчивых к данному препарату микроорганизмов, что искажа­ет реально существующую ситуацию и не позволяет получать достовер­ные результаты.

Факторы, обеспечивающие достоверность результатов анализа Принципиальное значение имеет масса образца, т. е. количество препарата, взятого для анализа. Чем больше масса образца, тем выше ста­тистическая достоверность вывода об отсутствии патогенных микроор­ганизмов. Например, при массе образца для анализа 1-5 г предваритель­но контаминированного препарата условно-патогенные микроорганизмы удавалось выявить только при нескольких повторных анализах. При уве­личении массы образца до 10 г положительный ответ удавалось получить с первого раза.

Вторым фактором, обеспечивающим достоверность ответа, являет­ся качество питательных сред. Питательные среды должны быть изго­товлены в строгом соответствии с указаниями ГФ, из компонентов, отве­чающих по качеству требованиям ГОСТ. Они должны храниться в усло­виях, исключающих их высыхание или увлажнение, и проверены на рос­товые свойства и стерильность. Под ростовыми свойствами понимают способность питательной среды обеспечивать эффективный рост специ­альных штаммов тест-микроорганизмов. На ростовые свойства, проверя­ют каждую новую партию среды. Стерильность контролируют путем тер-мостатирования образца приготовленной среды после ее стерилизации (отбирают 5 % от всего количества).

Третий фактор, влияющий на достоверность ответа, это отсутствие антимикробной активности препарата. Чтобы исключить попадание в объекты анализа посторонних микроорганизмов, анализ проводят в стро­го асептичных условиях в специальном помещении, полностью изоли­рованном от процесса производства.

Схема анализа НЛС, не обладающих антимикроб­ным действием

В соответствии с требованиями НТД в НЛС определяют общее чис­ло бактерий и грибов, а также возможное присутствие условно-патоген­ных микроорганизмов. Для этого используют 15 различных питательных сред, каждая из которых имеет определенный номер (табл. 28). Схема и методы анализа являются одинаковыми для всех видов НЛС, независи­мо от их лекарственной формы (твердой, мягкой, жидкой). Схема анализа включает следующие этапы:

• обогащение культур;

• первичная дифференциация (разделение по группам) на диффе­ренциально-диагностических средах;

• выделение «чистых» культур микроорганизмов;

• изучение морфологических и биохимических свойств выделенных культур;

• заключение о присутствии (отсутствии) конкретных культур на ос­новании совокупности признаков.

Общий принцип микробиологического контроля состоит в анализе так называемой выборочной пробы и в перенесении результатов контро­ля на всю серию или партию препарата.

Выборочная проба -это образцы, отбираемые из всей массы иссле­дуемого объекта при соблюдении принципа случайности выборки. Сери­ей (ши партией) препарата называют определенное количество продук­та, изготавливаемого в условиях, которые считаются постоянными. Ос­новным требованием к серии (партии) является ее однородность по пока­зателям качества. Для анализа ГЛС от каждой серии (не зависимо от объе­ма) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из равных разовых проб, взятых как минимум из 10 разных упаковок. Всего для про­ведения одного анализа по схеме используют 30 г лекарственного сред­ства: 10 г (мл) - для определения общего количества бактерий и грибов -мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов (МАФАМ), 10 г (мл) - для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (или Escherichia coli и Salmonella spp.), 10г(мл)-для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. В том слу­чае, когда необходимо подтвердить результат, проводят повторное испы­тание по конкретному разделу схемы анализа, используя при этом обра­зец 10 г (мл) из оставшегося от средней пробы.

Таблица 28

Перечень и назначение питательных сред, использующихся в схеме анализа нестерильных лекарственных средств

Название и номер среды по схеме	Назначение, особенность компонентного состава	Учитываемый признак, его проявление
Среда № 1	Количественное определение бактерий (МАФАМ).	Макроморфология и подсчет числа колоний.
Среда № 2	Определение количества грибов и дрожжей.	Макроморфология и подсчет числа колоний.
Накопительная среда № 3	Среда создает условия для преимущественного роста Г" палочек (при этом рост Г* бактерий подавлен внесенным в среду малахитовым зеленым).	Изменение цвета среды, признаки бактериального роста.
Дифференциал ьно- диагностическа я Среда № 4 (Эндо)	Идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae, Escherichia coli.	Способность ферментировать лактозу, появление красных (бледно-розовых) колоний с металлическим блеском (без блеска); рост микроорганизмов сопровождается изменением цвета среды в ярко-малиновый.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 5 (висмутсульфит агар)	Идентификация бактерий Enterobacteriaceae, Salmonella spp.	Черные (коричневые) колонии.
Накопительная среда № 8	Накопление Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus.	Изменение цвета среды, признаки бактериального роста.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 9 (с глицерином)	Выявление пигмента пиоцианина у Pseudomonas aeruginosa.	Изменение цвета среды с серовато-желтоватого на голубовато-зеленоватый (серо-зеленый); колонии серые, коричневые.
Дифференциал ьно диагностическая среда № 10 (с маннитом)	Выявление стафилококков.	Появление желтых, выпуклых колоний, окруженных желтыми зонами вследствие ферментации маннита.

При проведении испытания мембранным методом от каждой серии препарата отбирают среднюю пробу не менее 6 г (мл), если нет другого указания в частных Фармакопейных статьях. В зависимости от физичес­ких свойств лекарственной формы образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии:

твердые лекарственные формы, которые плохо растворяются, пред­варительно измельчают с использованием оборудования, исключающего дополнительное загрязнение микроорганизмами и суспензируют в фос­фатном буферном растворе рН 7,0 (или соответствующей жидкой пита­тельной среде), соблюдая соотношение объем препарата: объем буферно­го раствора 1:20;

жидкие лекарственные формы, а также твердые формы, растворяю­щиеся в буфере, готовят в виде растворов 1:10;

мягкие лекарственные формы, нерастворимые в воде, предваритель­но эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 с добавлением эмульгатора (например, твина - 80).

При подготовке к анализу используют стеклянные бусы при меха­ническом встряхивании и нагревании пробы до температуры не более 45 °С. Приготовленные образцы используют для определения общего ко­личества МАФАМ и условно-патогенных микроорганизмов, нормируе­мых в препаратах разных категорий.

Количественное определение микроорганизмов

Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри. Приготовленный раствор, суспензию или эмульсию препарата вносят по 1 мл в каждую из 2-х пробирок с 4 мл расплавленной и ох­лажденной до 45-50 °С среды № 1. Быстро перемешивают содержи­мое пробирки и переносят в чашку, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды № 1. Быстрым покачиванием чашки равномерно распределяют верхний слой агара до его застывания. Чашки инкуби­руют 5 суток при 30-35 °С.

При таком способе посева микроорганизмы, содержащиеся в ана­лизируемом образце, распределяются в тонком слое на поверхности сре­ды, где имеются благоприятные условия для роста аэробных и факульта­тивно-анаэробных бактерий. Слой питательной среды, предварительно внесенной в чашку, обеспечивает диффузию питательных веществ для прорастания колоний микроорганизмов.

После инкубирования посевов через 2 сут и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, нахо­дят среднее значение и умножают на показатель разведения для определе­ния числа МАФАМ в 1 г (мл) образца.

Для получения достоверных результатов учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 колоний. Если при посеве разведения препарата 1:10 на чашках нет роста, делают заключение о том, что в 1 г препарата содержатся менее 10 бактерий. Если число колоний превышает 300, делают ряд последовательных разведений образца.

Для определения общего числа грибов препарат засевают на среду № 2, используя двухслойный агаровый метод, как описано выше.

Количественное определение энтеробактерий за исключением Escherichia coli и Salmonella spp.

10 г или 10 мл испытуемого образца помещают в 100 мл среды №11, гомогенизируют и инкубируют при температуре 32,5±2,5 °С в тече­ние, как правило, двух часов, но не более пяти. В случае, если лекарствен­ное средство - суппозитории или растворы в маслах, в среду № 11 добав­ляют стерильный твин-80 в количестве не более 5 % и стеклянные бусы для эмульгирования.

Гомогенат перемешивают и готовят разведения 1:10 и 1:100, исполь­зуя для этого среду № 3. В три пробирки с 10 мл среды № 3 вносят 1 мл гомогената в первую, 1 мл разведения 1:10 во вторую и 1 мл разведения

1:100 в третью, то есть соответственно 0,1 г, 0,01 г, 0,001 г образца. Посе­вы инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на плотную среду № 4 (агар Эндо) и инкубируют чашки Петри при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае появления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамот-рицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по табл. 29.

Таблица 29

Количественное определение энтеробактерий

Количество испытуемого образца	Вероятное количество бактерий в 1 г (мл)
0,1 г (мл)	0,01 г (мл)	0,001 г (мл)
1 мл гомогената	1 мл гомогената в разведении 1:10	1 мл гомогената в разведении 1:100
+	+	+	Более 1000
+	+	-	От 100 до 1000
+		-	От 10 до 100
-	-	-	Менее 10

Обозначения: + наличие роста бактерий; - отсутствие роста бактерий

Количество клеток E.coli в 1 мг (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также данной таблицей.

Испытание на наличие Escherichia coli и Salmonella spp.

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл пита­тельной среды № 11 (лактозный бульон). В случае если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубиру­ют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 2-5 ч 10 мл среды № 11 пере­носят в 100 мл среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32,5± 2,5) °С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде № 3 (сре­да прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испы­тания продолжают.

Испытание на Е. coli

Со среды № 3 делают пересев петлей на среду № 4 (агар Эндо) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 18-24 ч. На среде № 4 Е. coli образуют, как правило, характерные малиновые колонии с ме­таллическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к Е. coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду № 1 и инкубируют при температуре (32,5±2,5)°С в течение 18-24 ч. Из про­бирок с чистой культурой делают пересевы на среды № 14 (агар Симмонса) в № 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на цитохромокси-дазу. Через 18-24 ч инкубации при (32,5±2,5) °С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах № 14 и № 15. Утилизацию цитрата уста­навливают по изменению цвета среды № 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды № 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую-щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизи­рующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

Испытание на виды Salmonella

1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл среды № 12 (селенитовая среда) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 16-18 час. Делают пересев петлей на среду № 5 (висмут-суль­фит агар) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 14-18 ч. На среде № 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные коло­нии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлеж­ность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на среду № 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру со среды № 1. Че­рез 18-24 ч инкубации при температуре (32,5±2,5) °С отмечают измене­ние цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной сре­ды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода -типичном признаке видов Salmonella.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую-щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не фермен­тирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

Образец препарата вносят в среду № 8 (1:10) и инкубируют 24-48 ч при температуре 30-35°С. После инкубирования пересевают на среды

№ 9 и № 10 в чашки Петри. При отсутствии роста на средах № 9 и № 10 после их инкубирования 24-48 ч делают заключение об отсутствии этих микроорганизмов в препарате.

При наличии на среде № 9 подозрительных на Pseudomonas aeruginosa колоний зеленоватых или серовато-зеленоватых, прозрачных, плоских, с изменением цвета среды в голубовато-зеленоватый и обладаю­щих специфическим запахом, проводят микроскопирование. При обна­ружении грамотрицательных палочек проверяют наличие цитохромокси-дазы.

Если в препарате обнаружены грамотрицательные неспорообразу-ющие палочки, дающие положительную реакцию на цитохромоксидазу и образующие сине-зеленый пигмент, значит в препарате присутствуют бактерии Pseudomonas aeruginosa и препарат к применению не пригоден.

При наличии на среде № 10 золотисто-желтых колоний, образован­ных грамположительными кокками и окруженных желтыми зонами, де­лают вывод о ферментации маннита. Чистую культуру стафилококка про­веряют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Если в препарате обнаружены грамположительные кокки, фермен­тирующие маннит и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, значит препарат контаминирован Staphylococcus aureus и к применению не пригоден.

Методы выявления антимикробной активности лекарственных препаратов

Определение антимикробной активности проводят однократно для всей номенклатуры препаратов, выпускаемых на конкретном производ­стве. Некоторые лекарственные препараты обладают выраженным анти­микробным действием в связи с их целевым назначением (для лечения инфекционных заболеваний). К ним относят: антибиотики, препараты, в состав которых введены антибиотики и химиотерапевтические препа­раты: сульфаниламиды, нитрофурановые, производные 8-оксихинолина, соли тяжелых металлов, производные фторхинолона и некоторые другие. Кроме того существует ряд лекарственных средств, способных оказывать неспецифическое антимикробное действие: кислоты (например, ацетил­салициловая кислота), щелочи, спирты, окислители, препараты, содержа­щие серу, фитонциды, эфирные масла, витамины, анальгетики и др.

В основе метода определения антимикробного действия лежит срав­нение интенсивности роста тест-микроорганизмов в присутствии и в от­сутствие препарата. В качестве тест-микроорганизмов используют опре­деленные штаммы Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans и Aspergillus niger. Заключение об отсутствии антимикробного действия делают при наблюдении одинаковой интенсивности роста всех культур в опытном и контрольном посевах.

Способы устранения антимикробного действия ле­карственных средств

Для НЛС рекомендованы такие методы:

увеличение рабочего разбавления препарата (за счет большого объе­ма фосфатного буферного раствора);

добавление специфических инактиваторов (например, пеницилли-назы для b-лактамных антибиотиков) или веществ, замещающих антиме­таболит (например, парааминобензойной кислоты для сульфаниламидов);

использование неспецифических инактиваторов-нейтрализаторов, особенно для препаратов с консервантами, например, 0,3-0,4 % раствор твина-80 и твина-20; 0,1-0,5 % раствор соевого лецитина, гистидина, ко­торые предварительно вносят в питательную среду.

Если все перечисленные методы неэффективны, а лекарственное вещество растворимо, то используют метод мембранной фильтрации.

4. Контроль стерильности лекарственных препаратов

Целью испытания на стерильность является подтверждение полно­го отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в объекте. В некото­рых случаях, например, в производстве вакцин проводят испытания на полное отсутствие вирусов в объекте.

Анализу подлежит каждая партия препарата. За партию (серию) при­нимают количество препарата, для которого вероятность нарушения или недостижения стерильности одинакова. Достоверность испытания на сте­рильность зависит от нескольких факторов:

объема (массы) образца для анализа;

состава и качества питательных сред;

используемого метода исследования;

соблюдения асептичных условий проведения анализа.

Объем образца.

В связи с тем, что метод испытания является разрушающим, отби­рать на анализ большое количество образцов невыгодно, вместе с тем есть риск получить неадекватный ответ, если проводить испытание на малом числе образцов из серий большого объема. Размер выборочной пробы устанавливают в зависимости от вида стерилизации и числа единиц в се­рии. Если лекарственное средство стерилизуют паром под давлением 0,11±0,02 МПа и температуре 121 °С, то образец состоит из 10 единиц, независимо от числа образцов в серии. При других видах стерилизации минимальное количество образцов определяют по формуле:

n = 0,4 √ N

где: п - число единиц для анализа; N-число единиц в исследуемой серии, при этом п должно быть не менее 3 и не более 40.

Качество питательных сред. Питательные среды должны быть максимально пригодны для контроля микроорганизмов, т. е. учитывать различные потребности, обеспечивающие прорастание клеток, хотя изве­стно, что универсальной среды практически быть не может. По современ­ной НТД применяют жидкие питательные среды тиогликолевую и Сабу-ро, а для иммунобиологических - только тиогликолевую. Эта среда обла­дает некоторыми преимуществами: снижает окислительно-восстанови­тельный потенциал и способствует росту анаэробных микроорганизмов, обеспечивает рост грибов, нейтрализует антимикробное действие неко­торых консервантов.

Контроль качества питательных сред проводят путем проверки сте­рильности и ростовых свойств для доказательства отсутствия торможе­ния роста. В качестве тест-микроорганизмов для тиогликолевой среды используют определенные штаммы Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Для проверки ростовых свойств среды Сабуро используют Candida albicans.

Для контроля стерильности проверяют 5 % от партии приготовлен­ной питательной среды путем выдерживания в термостате при температу­ре 30-35 °С 48 ч для тиогликолевой и 20-25 °С 70-72 ч для среды Сабуро.

Метод анализа. Контроль стерильности можно проводить двумя методами: прямым посевом образца в питательные среды и мембранной фильтрацией. При прямом посеве испытуемый препарат предварительно растворяют или суспендируют и вносят в среду в количестве, зависящем от объема содержимого одной единицы: если в ампуле 1 мл, то весь объем, для ампул объема \-\ мл засевают 1 мл, если объем составляет 5-19 мл -2 мл, для объема 20-100 мл - 2-4 мл, а при анализе содержимого флако­нов объемом более 100 мл предпочтительным является метод мембран­ной фильтрации. Объем питательной среды должен в 10 раз превышать объем образца для посева.

Посевы втиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35 °С, а в среде Сабуро - 20—25 °С. Продолжительность инкубации 14 суток.

Интерпретация результатов. Посевы просматривают ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оце­нивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других при­знаков микробного роста. Выявленный рост подтверждают микроскопи­ей мазков, окрашенных по Граму. Препарат считают стерильным при от­сутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в од­ной пробирке (колбе) испытание проводят повторно на таком же количе­стве образцов. При отсутствии роста испытуемый препарат считают удов­летворяющим требованиям. В случае роста микроорганизмов при повто­ром посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, обнаружен­ными в первичном посеве испытуемый препарат считают нестерильным. Если выявлена другая морфологическая группа, то испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста в третьем испытании препарат считают стерильным. Если хотя бы в одной пробирке обнаружен рост, испытуемый препарат считают нестерильным.

Испытание на стерильность методом мембранной фильтрации. Испытание проводят с использованием открытой или замкнутой систе­мы. При испытании в открытой системе используют фильтродержатели и мембраны диаметром 47 мм. Метод основан на фильтрации образца че­рез мембрану с порами 0,45 мкм со скоростью, предотвращающей про­скок микроорганизмов. При испытании препаратов с антимикробной ак­тивностью после фильтрации мембрану тщательно промывают раство­ром, объем которого определен заранее. Предварительно эксперименталь­но определяют тип и объем промывной жидкости, необходимой для пол­ного удаления антимикробного вещества. Полноту отмывки мембраны можно проверить биологически по тест-микроорганизмам или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Мембрану после отмы­вания растворяют в 2 мл ацетона и оценивают присутствие антимикроб­ного вещества.

В анализах на стерильность целесообразно использовать мембра­ны, выполненные из инертных полимерных материалов, не взаимодей­ствующих с антимикробными агентами. Для предотвращения подтекания фильтруемой жидкости под мембрану, применяют мембраны с гидрофоб­ным краем. После фильтрации мембрану стерильными ножницами разре­зают пополам и одну часть помещают в тиогликолевую среду, а другую в среду Сабуро с последующим термостатированием в течение 7 суток при ранее указанных температурах. Одновременно проводится контроль на асептичность посева. Используют такую же стерильную установку, через которую пропускают заведомо стерильную жидкость и производят посев. Параллельно ставят контроль на отсутствие следов антимикроб­ного вещества. После внесения мембраны во флакон со средой добавля­ют суспензию, содержащую приблизительно 100 клеток тест-микроорга­низмов. В случае их прорастания делают вывод об устранении антимик­робной активности.

Испытание на стерильность в закрытой системе «Стеритест» про­водят для препаратов с выраженным антимикробным действием или име­ющим объем более 100 мл (инфузионных растворов). Преимуществами метода мембранной фильтрации являются:

1) высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возмож­ности концентрирования или удержания на мембране даже единич­ных клеток при пропускании большого объема препарата;

2) высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при уст­ранении антимикробной активности;

3) сокращенные сроки испытания.

К ограничениям метода мембранной фильтрации можно отнести необходимость проведения испытания в строго асептичных условиях (при использовании открытой системы), необходимость использовать эффек­тивное оборудование, мембранные материалы, а также повышенные тре­бования к квалификации персонала.

Дата добавления: 2015-05-26