Цитогенетический метод

Для определения изменений в хромосомном аппарате, связанных с неправильным набором Х-хромосом, часто применяют относительно простой, но довольно информативный метод исследования полового хроматина. Для этого шпателем делают легкий соскоб со слизистой внутренней поверхности щеки, который наносят на стекло. Попавшие туда слущенные клетки соответствующим образом обрабатывают и рассматривают под микроскопом. В эпителиальных клетках женщин обычно обнаруживается одно темное пятнышко — тельце Барра. У мужчин, которые имеют только одну Х-хромосому, его нет. Отсутствует тельце Барра и у женщин с синдромом Шерешевского-Тернера. При наличии в кариотипе женщины двух дополнительных хромосом (при трисомии-Х) в клетках таких телец два и т. д.

Однако диагноз хромосомного заболевания считается установленным только в случае, если проведено кариологическое обследование, то есть изучен кариотип. Определение кариотипа трудоемко и дорого.

Показаниями для кариотипирования являются:

• выявленная патология полового хроматина;
• наличие у больного множественных пороков развития;
• задержка психоречевого и умственного развития в сочетании с повышением числа микроаномалий;
• повторные самопроизвольные аборты, мертворождения, рождение детей с пороками развития, хромосомной патологией (во всех этих случаях обследуется семейная пара, то есть обязательно муж и жена);
• возраст беременной 35 лет и старше.

Однако при таком подходе оставался недифференцированным ряд сложных случаев хромосомной патологии, таких как добавочная маркерная хромосома, сложные случаи хромосомного мозаицизма (в организме больного имеется несколько клонов клеток - нормальных и аномальных). На основе классических методов дифференцированного окрашивания были разработаны микроцитогенетические методы. Они основаны на анализе хромосом на ранних стадиях их деления - прометафазе и профазе. С помощью микроцитогенетичес-ких методов удалось выявлять до 2000-3000 дискретных сегментов на хромосомах, в отличие от классического анализа, при котором выявлялось до 300-400 сегментов.
Эти методы с использованием светового микроскопа широко применяются в практике цитогенетических лабораторий и позволяют выявлять более 100 хромосомных синдромов. Методы FISH-диагностики стали широко использовать для исследования хромосомных аномалий в интерфазных ядрах, что особенно важно с практической точки зрения, так как метод экономичен и занимает мало времени. В норме, если например у пациента или плода есть дисомия по 21-й хромосоме, к ядре будут видны две флюоресцирующие цветные точки. При наличии трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) будут видны три точки.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис. Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, пожалуй, самым точным и чувствительным методом диагностики инфекционных заболеваний.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Для определения генетического дефекта нужно знать, какой из генов затронут и где расположен этот ген. Мощным инструментом для определения пораженных генов и скрининга популяции людей на наличие измененного гена считается анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Широкое использование различных рестрикционных эндонуклеаз для анализа хромосомной ДНК выявило огромную вариабельность генома человека. Даже небольшие изменения в кодирующих и регуляторных областях структурных генов могут привести к прекращению синтеза определённого белка или к потере его функции в организме человека, что, как правило, сказывается на фенотипе пациента. Однако приблизительно 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, которые более изменчивы и содержат множество так называемых нейтральных мутаций, или полиморфизмов, и не имеют фенотипического выражения. Такие полиморфные участки (локусы) используются в диагностике наследственных заболеваний в качестве генетических маркёров. Полиморфные локусы присутствуют во всех хромосомах и сцеплены с определённым участком

гена. Определив локализацию полиморфного локуса, можно установить, с каким геном связана мутация, вызвавшая заболевание у пациента.

Для выделения полиморфных участков ДНК применяются бактериальные ферменты — рестриктазы, продуктом которых являются сайты рестрикции. Спонтанные мутации, возникающие в полиморфных сайтах, делают их резистентными или, наоборот, чувствительными к действию специфичной рестриктазы.

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть обнаружена по изменению длины рестрикцированных фрагментов ДНК, путём разделения их с использованием электрофореза и последующей гибридизации со специфическими ДНК-зондами. При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах будет выявляться один крупный фрагмент, а при её наличии будет присутствовать меньший по размеру фрагмент. Наличие или отсутствие сайта рестрикции в тождественных ло-кусах гомологичных хромосом позволяет достаточно надёжно маркировать мутантный и нормальный ген и проследить его передачу потомству. Таким образом, при исследовании ДНК пациентов, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофоре-грамме будут выявляться короткие фрагменты ДНК. У пациентов, гомозиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будут выявляться фрагменты большей длины, а у гетерозиготных — короткие и длинные фрагменты.

Дата добавления: 2015-07-02