Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Катализ» конформационных переходов (не только в рибосоме)




Пока о рибосоме.

Общие принципы функционирования рибосом.

1) Всякая рибосома трифункциональна (как минимум): она представляет собой
а) декодирующее устройство (генетическая функция),
б) пептидил-трансферазу (каталитическая функция), и
в) транспортную (прокачивает большущие массы тРНК и мРНК) молекулярную машину (функция транслокации).

2) Генетическая функция и каталитическая функция рибосомы четко
разделены между двумя рибосомными субъединицами -
малой и большой, соответственно. Большая субъединица может синтезировать пептидную связь, используя короткие субстраты, без всякой помощи малой субъединицы (вся энзиматическая активность действительно в большой).

3) Двигательная функция (функция транслокации – самая явная) требует
двух ассоциированных субъединиц.

4) Как транслокации, так и связыванию аминоацил-тРНК с рибосомой
способствуют (ускоряют) белковые факторы элонгации – EF1 и EF2, –
с потреблением энергии гидролиза ГТФ
(нуклеозидтрифосфат-зависимый «катализ» конформационных переходов). По сути ГТФ расходуется на катализ конформационных переходов.

 

Если посмотреть на энергетическую диаграмму транспептидации, по оси абцисс – путь реакции, по ординате – свободная энергия.

 

Имеется барьер, через который реакция должна перебраться. Он достаточно высок, если исходить из ямы претранслокационного состояния и обходиться без помощника (EF-G – уменьшает величину ямы, пунктиром). Из маленькой ямы проще забраться на барьер. Яма мелкая, так как у EF-G есть сродство к переходному состоянию, но это же сродство будет мешать нам с холма скатиться, то есть закончить реакцию и его надо прекратить. Каким образом? Надо поменять конформацию EF-G за счет гидролиза ГТФ. В нормальных энзиметических реакциях исчезновения сродства активного центра к переходному состоянию происходит просто за счет химии: переходное состояние переходится и интермедиат распадается, сродства больше нет, реакция может быть закончена. А здесь мы катализируем конформационный переход, надо что-то разрушить для изменения сродства. И природа нашла выход – разрушить макроэрг, связанный ГТФ. Его контакты с фактором меняются, фактор меняет конформацию и сродство к переходному состоянию пропадает. А куда девается энергия, высвободившаяся при гидролизе ГТФ? Она диссипирует в тепло, она больше ни для чего не нужна. То есть гидролиз ГТФ ни с чем не сопряжен на рибосоме.

Еще одно важной свойство конформационного катализа на больших молекулах – крупноблочная подвижность.

Дело в том, что крупные ферментные комплексы работают с крупными лигандами, связывания лиганда многоточечное. Тогда его узнавание или диссоциация может столкнуться с грандиозными барьерами (и энергетическими, и кинетическими). Пример: связывание магнитика с холодильником, если только одна точка, то его легко наклеить и легко поправить. А если магнит заменить на магнит из дисковода компьютера, тут нам поправить не удастся, холодильник просто вырвет у на сиз рук магнитную наклейку и она косо пристанет к нему, связывание слишком сильное, многоцентровое. Выход – гибкая стенка холодильника, его можно прогнуть и отцепить от него. Крупноблочная подвижность лиганда – это и есть гибкий холодильник.

То есть к общим принципам функционирования рибосом добавляется пятый:

5) Функционирующая рибосома характеризуется
внутри-субъединичной и меж-субъединичной крупноблочной подвижностью,
которая вовлечена в транслокационный механизм,
а также в механизмы связывания аминоацил-тРНК
и освобождения деацилированной тРНК.

Частично уже этого коснулись. Самый масштабный процесс – смыкание/размыкание субъединиц при функционировании рибосомы.

Связывание лиганда должно приводить к компактизации фермента за счет него (например, при связывании фактора Tu). Сомкнутое состояние должно соблюдаться при проведении химической реакции, а вот связывание первичных лигандов, из миграция и уход должны происходить при разомкнутом состоянии фермента. Это очень важно для работы молекулярных машин. Тоже самое написано на слайде 40 лекции 5.

Классический пример (связывание ААтРНК с Tu):

 

 

Без нуклеотид-трифосфата (или с ГДФ) структура фактора разомкнута, домен 1 свободно осциллирует около доменов 2 и 3. Как только появляется ГТФ (поворот спирали, возникновение гидрофобных контактов), структура становится жесткой и сомкнутой. И эта сомкнутость организует междоменную щель, которая связывает акцепторный стебель тРНК вместе с АК остатком.

Нечто похожее, только более масштабное и в случае рибосомы. Впервые концепцию смыкания-размыкания предложил Спирин, основываясь просто на том факте, что все рибосомы во всех организмах двухсубъединичны, ну почему не из одной, ну явно подвижность. И эта подвижность должна быть связана с прокачкой тРНК и мРНК сквозь нее (транспортная функция).

Смыкание/размыкание, если очень грубо, то изменение расстояния между центрами масс субъединиц. Плотно сомкнутая рибосома и не очень плотно сомкнутая рибосома. Смыкание происходит при связывании субстрата, то есть ААтРНК. А после транспептидации рибосома размыкается и это обеспечит необходимую подвижность для транслокации.

 

Первое экспериментальное доказательство, что рибосома не железобетонная конструкция было получено с помощью ЯМР, анализировали подвижность доменов в белке L7/L12 (выступ). Было показано, что С-концевые глобулярные домены очень свободно соединены со спиральным доменом, который находится уже на рибосоме. То есть они двигаются почти независимо, так как соединены гибкими линкерами, которые еще называют шарнирами. И ЯМР видит эту подвижность.

 

При РСА рибосом пальца L7/L12 не видно, так как он очень подвижный, но эта подвижность обеспечена не только гибкостью сочленения, но и тем, что спиральный домен взаимодействует с белком L10, а тот в свою очередь с L11, и вместе они сидят на пучке рибосомных РНК. А этот пучок подвижен. То есть и С-концевые домены болтаются, и основание тоже болтается. Вот его и не находит РСА.

 

Тоже самое было обнаружено и для белка L1. Правда, этот белок удалось немного заморозить, точнее его выступ (участок РНК, на котором он сидит, в нескольких состояниях). И видно размах движения на рибосоме. L1 белок имеет сродство к внешнему углу деацилированной тРНК в Е-участке. Его качание имеет функциональное значение - -помогает выходу деацилированной тРНК из Е в раствор.

А вот так малая рибосомная субъединица зажимает правильные кодон-антикодоновые дуплексы у себя на шее (слайд 46 – динамика):

 

Движение головы в сторону плеча и плеча в сторону головы, это движение еще сопровождается легким поворотом, но в этой проекции его не видно. Так или иначе дуплексы оказываются зажаты между головой и телом. Парономицин помогает здесь связыванию, так как используется не полная тРНК, а только ее антикодоновая петля (это в динамике).

И, наконец, вращательное (или винтовое) движение малой субъединицы относительно большой:

 

Это движение, которое впервые увидели в криоэлектронный микроскоп, было потом доказано с помощью другого подхода. На картинке нас смотрит малая субъединица, а под ней большая. Малая против часовой стрелки может двигаться относительно большой туда и обратно. Ось вращения через ПТЦ и перпендикулярна плоскости компьютера (перпендекулярна поверхности контакта между субъединицами). Чтобы увидеть это движение не в кристалле, а в растворе была применена техника Фертсревского резонансного переноса энергии. На рибосомные белки были навешены флуорофоры (на S11, L9, S6) и оказалось, что расстояние между S11 и L9 может уменьшаться, а между L9 и S6 может увеличиваться. Причем осцилляционно.

С применением такой же техники было показана миграция ССА концов. Причем была разработана технология FRET на одной молекуле. Мощный метод:

 

 

Суммирование сказанного:

Подвижные блоки и наблюдаемые подвижки в рибосоме:

1) 50S субъединица: L7/L12 стержень – свободно движется относительно рибосомы, но при связывании факторов его движение замораживается (было показано сначлаа с помощью ограниченного протеолиза, а затем ЯМР).
L1 выступ – сдвиг к и от тела большой субъединицы, (дистально и проксимально). Достаточно частые колебания. В сомкнутом состоянии они замирают.

2) 30S субъединица: Плечо – сдвиг к головке и к основанию L7/L12 стержня (фактор-связывающий участок на рибосоме).
Клюв (выступ головки) – «кивание», в общем то следить можно по повороту шеи – поворот вокруг оси (~12°).

3) 70S рибосома: Смыкание-размыкание рибосомных субъединиц (крупномасштабное движение).

Вращательный сдвиг малой субъединицы
относительно большой против часовой стрелки (~6°-10°). Эти 6 градусов если померять расстояние на периферии вращения оказываются 8 ангстремами (такое расстояние, которое можно мерять с помощью переноса энергии).

 




Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-01-03; Просмотров: 501; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.018 сек.