Единицы измерения скорости ферментативных реакций

Кинетика ферментативных реакций

Химическая кинетика - это учение о скоростях и механизмах химических реакций. Ферментативная кинетика изучает закономерности влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия на скорость ферментативных реакций.

Скорость ферментативных реакций определяется изменением количества субстрата или продукта за единицу времени. Скорость ферментативных реакций является мерой каталитической активности фермента. Математически она выражается в изменении количества субстрата (уменьшении) и продукта (увеличении) в единицу времени:

D [S] D [P]

V = ------------- = -----------

t t

Вначале реакции скорость увеличивается пропорционально времени и имеет прямолинейную зависимость, но постепенно она снижается вследствие уменьшения концентрации субстрата, увеличении концентрации продукта. Кроме того, на скорость ферментативной реакции влияют: присутствия регуляторных молекул активаторов и ингибиторов, температуры, рН среды и других факторов. Рассмотрим их влияние.

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавше-гося продукта. Для выражения каталитической активности Комиссией по ферментам Международного биохимического союза в 1961 г. была рекомендо-вана стандартная единица, обозначенная на русском языке – МЕ- международная единица активности.

С т а н д а р т н а я е д и н и ц а - это такое количество фермента, которое при оптимальных условиях реакции катализирует превращение 1 микромоля субстрата за 1 минуту. Оптимальные условия для каждого фермента зависят от температуры, рН раствора, отсутствия активаторов и ингибиторов.

1ммоль превращенного субстрата

1МЕ = ----------------------------------------------

1 мин

Отсюда, количество единиц активности фермента можно вычислить по формуле:

Количество превращенного субстрата(ммоль)

nМЕ = -----------------------------------------------------------

Время (мин)
В 1973 г. той же Комиссией предложено выражать активность ферментов в к а т а л а х. 1 Катал (символ – кат) - это такое количество фермента, которое способно превращать один моль субстрата за одну секунду (при оптимальных условиях).
Количество превращенного субстрата (моль)

n катал = -----------------------------------------------------------

Время (сек)

Международная единица активности фермента связана с каталом следующим равенством:

1 кат = 1 моль S/с = 60 моль S/мин = 60∙10⁶ мкмоль/мин = 6∙10⁷ МЕ.

1МЕ = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

В медицинской практике для оценки активности фермента чаще используют МЕ. Для оценки количества молекул фермента среди других белков ткани определяют удельную каталитическую активность (Уд.ак.) ферментов, равную

количеству единиц активности фермента (nМЕ) в образце ткани, деленному на массу (мг) белка в этой ткани:

Количество превращенного субстрата(ммоль)

Уд.ак. = -----------------------------------------------------------

Время (мин) ∙ массу белка (мг)
Удельную каталитическую активность фермента или ферментативного препарата выражают также и в каталах на 1 кг белка (кат·кг^-1) или чаще в мккат на 1мг белка.

По удельной активности судят о чистоте фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше его удельная активность.

Концентрацию фермента в растворе выражают в каталах на 1 литр (кат·л^-1) или в других, кратных этому значению величинах.

6.2. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции
Ферментативные реакции, в отличие от неферментативных, обладают очень важной особенностью - насыщения фермента субстратом.

При низких концентрациях субстрата скорость реакции пропорциональна его концентрации и по отношению к субстрату - это реакция первого порядка. С увеличением концентрации субстрата приращение скорости с каждым разом уменьшается и, наконец, она становится практически независимой от неё. В этих условиях реакция по отношению к субстрату - нулевого порядка, а весь фермент полностью насыщен субстратом и не может функционировать быстрее. Скорость ферментативной реакции при полном насыщении фермента субстратом называется м а к с и м а л ь н о й с к о р о с т ь ю. Дальнейшее повышение концентрации суб­страта не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу.

]

Зависимость скорости реакции катализируемой ферментом, от концентрации субстрата.
V_max-максимальная скорость реакции при заданной концентрации фермента; К _m- константа Михаэлиса

Скорость реакции пропорциональна концен­трации фермент-субстратного комплекса ES, а скорость образования ES зависит от концен­трации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.

Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента нахо­дятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент- субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = [ES].

Таким образом, концентрация фермента — лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.

k₁ k₂
E + S<====> ES ===> E + P,

k_-1

Где: k₁ — константа скорости образования фер­мент-субстратного комплекса;

k_-1, — константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного

комплекса; k₂ — константа скоро­сти образования продукта реакции.

Отношение констант скоростей (k _-1 + k₂ ) / k₁ называют константой Михаэлиса и обозначают К_m.

Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:

V = К_m + [S]
В случае, когда скорость реакции равна поло­вине максимальной, K_m = [S] (рис.). Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достига­ется половина максимальной скорости.

Уравнение Михаэлиса—Ментен — основное уравнение ферментативной кинетики, описы­вающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Данное уравнение позволяет легко измерять максимальную скорость из экспериментальных данных, полученных при любой фиксированной концентрации фермента.

Если концентрация субстрата значительно больше K_m (S>>K_m), то увеличение концентра­ции субстрата на величину К_т практически не влияет на сумму (K_m + S) и её можно считать равной концентрации субстрата.. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = V_max. В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно меньше K_m (S<<K_m), то сумма (K_m + S) примерно равна К_т, следовательно, V = V_max[S]/K, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (имеет первый порядок).

V_max и К_m — кинетические характеристики эффективности фермента.

V_max даёт характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной конце фермента и в условиях избытка субстрата.

К_т характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше К_т, тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот.

6.3 Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции.
При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента. При построении графика эта зависимость будет линейной. При увеличении концентрации фермента увеличивается скорость ферментативной реакции, однако, в клетках организма и в производственных условиях катализ всегда осуществляется в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата.

Рис. Влияние концентрации фермента на скорость реакции:

V - скорость реакции; [E] - концентрация фермента.

[Е]

V = -------------

t

Количество фермента и его активность выражаются в международных единицах активности и каталах (см.выше).

Дата добавления: 2014-01-03