Выделение микроорганизмов - продуцентов антибиотиков

Основными продуцентами антибиотиков являются актиномицеты, плесневые грибы, бактерии. Главным местом их обитания явля­ется почва. Для выделения микроорганизмов, образующих антибио­тики, берут пробы почвы, высушивают ее до воздушно-сухого состо­яния и делают высевы на специальные питательные среды.

Для выделения актиномицетов, являющихся основными проду­центами антибиотиков, используют синтетические питательные сре­ды, в которые в качестве источника углерода добавляют крахмал или глицерин. В качестве источника азота в среды добавляют нитратные соли. На этих средах рост бактерий подавляется, а грибы развивают­ся в малом количестве. Чтобы они росли лучше, нужно подкислить среду до рН = 4 - 4,5. Можно также использовать среду Чапека, агаризированную почвенную вытяжку.

Выделенные культуры микроорганизмов-антагонистов изучают по содержанию в них антибиотических веществ, необходимых для прак­тических целей. При этом методом хромотографии определяют на­личие известных антибиотиков. Если обнаруживают новый антиби­отик, то вначале осуществляют первичное выделение и химическую очистку антибиотика, определяют его токсичность и химико-тера­певтические свойства на животных, зараженных возбудителями раз­личных заболеваний.

Выделенные штаммы-продуценты антибиотиков часто вариабель­ны и нестабильны. Поэтому методом селекции отбирают наиболее перспективные штаммы, а затем проводят отбор индуцированных мутантов. Мутантное действие на микроорганизмы достигается при­менением различных источников лучистой энергии (УФ-лучи, рент­геновские лучи, нейтроны и др.).

Культивируют мутантные штаммы на богатой питательной среде. Процесс контролируют либо по концентрации биомассы, либо по концентрации питательных веществ в среде.

Биосинтез молекулы любого антибиотика происходит с участием ряда ферментов - от нескольких единиц до нескольких десятков. Координация действия ферментов, т.е. обеспечение правильной последовательности ферментативных реакций, обеспечивается разны­ми, не всегда еще ясными путями.

Процесс развития микроорганизмов (продуцентов антибиотиков) имеет, как правило, двухфазный характер.

Первая фаза развития (трофофаза, или фаза сбалансированного роста) характеризуется тем, что в культуре продуцента антибиотика происходит быстрое накопление биомассы, сопровождаемое интен­сивным потреблением основных компонентов субстрата (источни­ков углерода, азота, фосфора и др.), некоторым снижением значения рН среды в результате образования кислых продуктов. Биосинтез антибиотика в этот период не происходит или осуществляется в не­значительном количестве.

Вторая фаза (идиофаза - фаза несбалансированного роста) харак­теризуется снижением общего количества биомассы. В период вто­рой фазы происходит развитие микроорганизма и образование но­вых клеток, но в культуре начинают преобладать автолитические процессы, что приводит к снижению общего числа биомассы. Среда обогащается продуктами обмена и продуктами автолиза клеток, воз­растает значение рН, происходит бурный процесс биосинтеза анти­биотика.

По окончании приготовления антибиотиков их проверяют на ак­тивность по отношению к тест-штаммам.

Методов определения активности антибиотиков много. Но глав­ными из них являются микробиологические.

Способность убивать или тормозить рост и развитие микроорга­низмов называют биологической активностью препарата. В связи с этим различают цидное и статическое действие веществ. Например, антибиотики обладают фунгицидным, бактерицидным действием или фунгистатическим и бактериостатическим действием.

Для количественного определения активности антибиотика вве­дено понятие единицы действия (ЕД). При определении активности выделенного антибиотика обычно в качестве эталона используют химически чистый препарат с заранее известной величиной актив­ности.

ЕД - это активность определенного весового количества антиби­отика, принятого за эталон.

Так, ЕД пенициллина - это минимальная доза, подавляющая рост тест-штамма золотистого стафилококка в 50 мл питательного бульо-

на. Если чистый кристаллический пенициллин задерживает рост зо­лотистого стафилококка в разведении 1: 83000000, то в 1 г антибио­тика содержится 1666000 ЕД (83000000: 50 = 1666000) или 1666 ЕД в 1 мг.

Определение активности антибиотика проводят методом его се­рийных разведений в жидких или плотных питательных средах, а также методом диффузии антибиотика в агаре.

Кроме микробиологического метода контроля применяют хими­ческие и физико-химические методы: колориметрический, хроматог-рафический, спектрофотометрический.

Дата добавления: 2014-01-03