Метод селективных сред

Метод селективных сред – метод применяется в генетике микроорганизмов; позволяет изучать наличие и проявление (экспрессию) генов.

Для выявления биохимических мутантов их проверяют на способность расти на минимальной среде. Ледерберг предложил использовать для этих целей так называемый метод отпечатков. К покрытой бархатом печатке в форме чашки Петри прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. Затем к этой же печатке прикладывают две чашки с минимальной и полной средой. После инкубации колонии сопоставляют, накладывая чашку на чашку и совмещая колонии. Те колонии, которые не проявляются при этом на минимальной среде, могут быть отнесены к биохимическим мутантам. Для учета обратных биохимических мутаций, т.е. от ауксотрофного к прототрофному типу, применяют метод селективных сред, т.е. составляют среды без какого-либо метаболита, на которых могут расти только клетки определенного генотипа. Например, высевая культуру Е. coli, нуждающуюся в витамине биотине на минимальную среду, можно отбирать мутации, восстанавливающие способность синтезировать биотин. Вопрос о том, возможна ли рекомбинация, т.е. обмен генетическим материалом у прокариот, долгое время оставался открытым. Однако решение его имело глобальное значение для биологии с точки зрения установления общности генетических закономерностей для всех живых организмов, поэтому усилиями ряда ученых уже к 1952г. были установлены три основных механизма рекомбинации у прокариот: конъюгация, трансформация и трансдукция.

Возможность полового процесса у бактерий была продемонстрирована результатами электронно-микроскопических исследований, а доказательством тому, что при конъюгации клеток осуществляется процесс рекомбинации генетического материала, послужили результаты опытов Тейтума и Ледерберга. Они смешивали два ауксотрофных штамма Е. coli, один из которых нуждался для роста в треонине (Т"), лейцине (L") и тиамине (В|"), а друтие - в биотине (В"), фенилаланине (Ра") и цистеине (С"). Каждый из этих штаммов в отдельности погибает на минимальной среде, а при посеве их смесью прототрофные клетки появлялись в культуре с частотой 10"⁶ - 10"⁹. Присутствие у таких клеток всех 6 нормальных аллелей служит доказательством тому, что произошла рекомбинация генетического материала бактерий, которая объединила часть хромосомы одного штамма с частью хромосомы другого в результате полового процесса. Контакт между хромосомами двух клеток, сопровождающийся кроссинговером, осуществляется через цитоплазматический мостик, образующийся между конъюгирующими клетками. Установление полового фактора F у бактерий в виде плазмиды, т.е. небольшой внехромосомиой молекулы ДНК, явилось важным открытием (Хейс, 1952). Половой фактор присутствует только у бактерий мужского пола, которые служат донорами генетического материала, а женские клетки бактерий - реципиентами. Конъюгация сопровождается переходом F-фактора. который для удобства обозначается как F⁺ из мужской клетки, в женскую. Последняя не имеет полового фактора и условно обозначается как F^-. Среди мужских клеток некоторые способны к очень высокой частоте рекомбинаций - это Hfr-клетки (high frequency of recombination). F-фактор, если он присутствует в клетке, может вести себя двояко: как автономная цитоплазматическая частица (в клетках F⁺) или как локус бактериальной хромосомы (в клетках Нfr). В последнем случае плазмида становится эписомой. Плазмиды и эписомы способны к взаимному превращению. Разрыв кольцевой хромосомы бактерии происходит справа или слева от фактора F и свободный от фактора F конец хромосомы становится начальной точкой переноса группы сцепления генов бактерии - это локус о (или origin). В клетку-реципиент (F^-) входит однонитевая ДНК из клетки донора. Ее переход осуществляется по типу «катящегося кольца». В результате этого процесса в клетке-реципиента оказывается две хромосомы, а в клетке донора - одна. Гены, вошедшие при конъюгации в F^-- клетку, включаются в ее хромосому способом, аналогичным кроссинговеру. И при делении такой оплодотворенной клетки появляются рекомбинанты. Для картирования генов у кишечной палочки Жакоб и Вольман разработали особый метод. Они смешивали культуру двух линий, маркированных теми или иными генами, затем на протяжении двух часов через определенные промежутки времени прерывали конъюгацию путем сильного встряхивания в смесителе, отделяя доноров от реципиентов.

Другим способом рекомбинации генетического материала у бактерий является трансфомация. Явление трансформации было открыто в 1928г. Гриффитсом в опытах с пневмококками. У пневмоккоков известны два штамма: вирулентные (11IS), имеющие полисахаридиую капсулу и образующие гладкие колонии, и авирулентные (IIR) -бескапсульные, растущие в виде шероховатых колоний. Гриффитс смешивал авирулентный штамм с убитым нагреванием вирулентным и наблюдал гибель зараженных этой смесью мышей. Изучение популяций бактерий из инфицированных мышей показало, что часть авирулентных клеток IIR превратилась в вирулентные клетки IIIS. Это означало, что какое-то вещество из убитых клеток 111S переходило в живые штаммы IIR и изменяло (трансформировало) их. Только в 1944г. Эйвери, Мак-Леод и Мак Карти в условиях пробирочной культуры доказали, что трансформирующим агентом является ДНК. Они действовали на три разные пробирки со смесью авирулентных и убитых нагреванием вирулентных штаммов ДНК-азой, РНК-азой или протеазой. Эти фрагменты ДНК, растворенные в наружной среде, могут проникать только в компетентные клетки, т.е. клетки, имеющие соответствующие рецепторы на своей поверхности.

Третий механизм генетической рекомбинации у бактерий - трансдукция. Его открыл в 1951г. Зиндер. Трансдукция обусловлена способностью умеренного фага переносить гены от бактерий-доноров к бактериям-реципиентам. Известны два типа бактериофагов: вирулентные и умеренные. Вирулентные после размножения в клетке приводят ее к лизису. Они существуют либо в вегетативном состоянии (при размножении внутри клетки), либо в зрелом (метаболически инертном состоянии вне клетки). Умеренные фаги кроме вегетативного и зрелого могут быть также в состоянии профага. Бактерии, несущие профаг, называются лизогенными. Они приобретают иммунитет к дополнительному заражению таким же фагом. Состояние профага временное. Умеренный фаг, заражая бактерии, может вызвать как литическую, так и лизогенную реакцию в зависимости от физиологического состояния культуры.

Дата добавления: 2017-01-14