Реакция нейтрализации вирусов как один из основных методов,применяемых в диагностике вирусных инфекций .Сущность методы постановки

Ответ

Принципы специфической профилактики и иммунотерапии вирусных инфекций. Противовирусные химиотерапевтические препараты, механизмы их противовирусного действия. Вирусные вакцины, типы, примеры.

Ответ

Ответ.

Ответ

Приобретенный противовирусный иммунитет действует целенаправленно на определенный патоген.

Одним из самых важных механизмов специфической противовирусной защиты являются иммунные клеточные реакции, осуществляемые Т-эффекторами, где основную роль играют цитотоксические клетки CD8+ (Т-киллеры). Индуцированные вирусными антигенами Т-лимфоциты приобретают свойства распознавать вирусные антигены, экспрессированные на поверхности зараженных клеток совместно с антигенами гистосовместимости первого класса. В очагах размножения вирусов концентрируются Т-киллеры и вызывают цитолиз зараженных клеток без участия специфических антител.

Цитолитическое действие играет ведущею роль:

-против вирусов, освобождающихся путем почкования

-при инфекциях, при которых вирусы распространяются через мембраны в соседние клетки.

-против клеток, зараженных онкогенными вирусами.

Только при инфекциях, при которых вирусы быстро разрушают поражённые клетки (аденовирусы), клеточный иммунитет не имеет большого значения.

В-лимфоциты играют важную роль в обеспечении гуморального специфического иммунитета. При контакте с антигеном трансформируются в плазматические клетки, способные к продукции антител. Также они могут выступать в качестве антигенпрезентирующих клеток, продуцируют цитокины.

Специфические антитела.

Антитела-особый вид белков, которые вырабатываются в ответ на введение антигенов и обладают способностью специфически связываться с гомологичным антигеном.

На внеклеточный вирус. Осуществляют пространственную блокаду вирусных прикрепительных белков, предотвращая связывание вириона с клеточными рецепторами. В нейтрализации сложно устроенных вирусов комплекс между антителом и вирионом вызывает активацию системы комплемента. По классическому пути. Антитела, связанные с вирусными частицами, опсонизируют фагоцитоз.

На внутриклеточный вирус. Способны вызывать разрушение клетки, зараженной вирусами, активируя систему комплемента, что ведет к ее лизису (происходит только при высокой экспрессии вирусных антигенов). При невысокой экспрессии генов наиболее эффективным способом защиты является антителозависимая клеточная цитотоксичность. При этом клетки связываются с иммуноглобулинами, затем происходит связывание с нормальными киллерами, макрофагами, которые выбрасывают перфорины, вызывая лизис клеток.

Местный иммунитет формируется в наиболее вероятных входных воротах инфекции- в пределах кожных покровов и слизистых. В секретах слизистых доминирует секреторный иммуноглобулин А. Задача: обеспечение локального иммунитета в пределах тканей.

-является первой линией защиты

-при развитии инфекции прослеживается переход местного иммунитета в общий

-постоянный обмен факторами иммунитета (антителами) между местным и общим иммунитетом.

Раздел Вирусология Вопрос 7.

Интерфероны: классификация, биологические свойства. Индукторы интерферонов. Механизмы противовирусного действия интерферонов. Принципы получения и практическое применение интерферонов.

Интерфероны являются главными антивирусными гуморальными специфическими факторами.

1. Альфа-интерфероны продуцируются лейкоцитами. Основное биологическое свойство – подавление синтеза вирусных белков;

2. бета-интерфероны- фибробластами, обладает антивирусной активностью, ингибируя размножение вирусов, а также повышает активность цитотокических клеток.

3. гамма-интерфероны вырабатываются Т-лимфоцитами после их активации. ОН ингибирует специфический иммунный ответ, повышая активность НК-клеток и макрофагов.

Биологические свойства: ⎫

обладают видовой специфичностью – ИФН человека активен и оказывает действие только в организме человека;

-оказывает универсальное ингибирующее действие как на ДНК-, так и на РНКгеномные вирусы, но разные вирусы по разному чувствительны к ИФН;
-иммуномодулирующее действие – усиливают фагоцитоз, повышают активность НК-клеток, специфических цитотоксических клеток;
- противоопухолевое действие;

- являются слабыми антигенами

Универсальный механизм действия интерферонов заключается в разрушении вирусных иРНК и блокировании инициации стадии трансляции белков.

Индукторы интерферонов.

Кроме экзогенных интерферонов для лечения и профилактики применяют препараты, индуцирующие выработку эндогенных интерферонов клетками самого организма. Эти препараты называют индукторами интерферонов. Они имеют различную химическую природу, обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами. Разные препараты-индукторы вызывают максимальное накопление ИНФ в определенных органах и тканях, что позволяет их использовать для лечения конкретной инфекции. Эти препараты еще не нашли должного места в лечении и профилактики (по сравнению с экзогенными ИНФ), но обладают рядом преимуществ: разнообразным спектром, более длительно сохраняются в организме, не имеют побочных эффектов. Про получение нигде ничего не написано!!!!

Раздел Вирусология Вопрос 8.

Принципы лечения вирусных инфекций. Противовирусные лекарственные средства: подразделения, механизмы действия, эффективность.

1. Противовирусные химиопрепараты -это этиотропные препараты, которые влияют на отдельные звенья репродукции тех или иных вирусов, тем самым препятствуя их воспроизведению. Эффективны для ограниченного круга вирусных инфекций(герпесвирусы, ВИЧ-инфекции др.).Для многих вирусных инфекций этиотропные средства отсутствуют. Обладают узким спектром действия. Нередко к ним развивается устойчивость. Не дают гарантии полного освобождения от вирусов. Поэтому они далеки от совершенства. Необходимо применять совместно с другими препаратами.

2. Интерфероны (экзогенные). Обладают широким спектром действия, к ним не вырабатывается устойчивость.

-ИНФ 1-го поколения- природные, получаемые из клеток крови и культур клеток, обработанных неопасными для человека вирусами. Или другими индукторами ИНФ.

-ИНФ 2-го поколения – рекомбинантные, разработанные с помощью генно-инженерных методов.

3. Кроме экзогенных интерферонов для лечения и профилактики применяют препараты, индуцирующие выработку эндогенных интерферонов клетками самого организма. Эти препараты называют индукторами интерферонов. Они имеют различную химическую природу, обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами. Разные препараты-индукторы вызывают максимальное накопление ИНФ в определенных органах и тканях, что позволяет их использовать для лечения конкретной инфекции. Эти препараты еще не нашли должного места в лечении и профилактики (по сравнению с экзогенными ИНФ), но обладают рядом преимуществ: разнообразным спектром, более длительно сохраняются в организме, не имеют побочных эффектов.

4. Иммуномодуляторы - вещества, способные влиять на иммунную систему, стимулируя или угнетая ее. Это широкий круг химических соединений, который подразделяют на:

-эндогенные ИМФ-цитокины (интерлейкины, интерфероны и др.)

-экзогенные ИМ естественного происхождения (некоторые вакцины, различные компоненты микроорганизмов и др.)

-экзогенные ИМ синтетические высоко- и низкомолекулярные(Полифосфаты, полисульфаты и др.)

ИМ применяют в комплексе с другими препаратами преимущественно при длительно текущих заболеваниях.

Раздел Вирусология Вопрос 9

Вакцины- иммунобиологические препараты, изготовляемые из живых аттенуированных или инактивированных микроорганизмов, их антигенов и используемые для создания специфического активного искусственного иммунитета.

В основном их применяют с профилактической целью, иногда и с лечебной.

1. Живые вакцины готовят из аттенуированных вирусов. Их получают путем пассажей на маловосприимчивых животных, в куриных эмбрионах. Они обладают высокой иммуногенностью(формируется длительный напряженный иммунитет), их просто вводить(достаточно однократного введения), могут формировать и местный иммунитет. При этом их очень длительно прилучать, не исключена опасность реверсии вакцинного штамма в вирулентный, возможны осложнения. Противопоказаны лицам, страдающим иммунодефицитами. Примеры: полиомиелитная, гриппозная, коревая, краснушная, паротитная.

2. Инактивированные вакцины вызывают иммунный ответ гуморального типа. Для их приготовления используют вирусы, содержащие проективные антигены, активность которых должна сохраняться при действии физических факторов. Создают менее напряженный иммунитет, не индуцируют местный иммунитет, требуется 2-3х кратное введение. Обладают токсичностью и аллергенностью. Никогда не вызывают инфекционное заболевание. Пример: антирабическая(против бешенства), инактивированная гриппозная, против клещевого энцефалита, гепатита А

3. Химическая вакцина. Содержат отдельные структурные компоненты вирионов. Обладают иммуногенностью и хорошо переносятся, у них низкая реактогенность и аллергичность, менее токсичны. В них добавляют адъюванты, которые усиливают иммуногенность вакцинных агентов. Пример: вакцина гриппозная тривалентная полимер-судъединичная жидкая(Гриппол)

10. О сновные методы лабораторной диагностики вирусных инфекций: микроскопический, вирусологический, серологический, молекулярно-генетический. Характеристика прямых (обнаружение вируса, вирусных антигенов и нуклеиновых кислот) и непрямых (вирусологические, серологические) методов лабораторной диагностики вирусных инфекций. Информативность, преимущества и недостатки. Сравнительная характеристика методов.

Микроскопические методы исследования в вирусологии

1. Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая. Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

2. Световая микроскопия

В светом микроскопе можно увидеть крупные вирусы,а также внутриклеточные включения в пораженных вирусом тканях. Крупные вирусы выявляют путем серебрения по Морозову. Для выявления внутриклеточные включений приготавливают гистологические срезы из пораженных тканей, препараты-мазки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение телец Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве(препараты окрашивают по Туревичу, Ману)

Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении антигенов со специфическими противовирусными антителами, мечеными, флюорохромным красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии.

2. Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию. Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы. До интенсивного развития и внедрения в широкую практику метода культуры тканей и клеток применялось заражение экспериментальных животных или эмбрионов курицы. Эти методы применяются и в настоящее время. Выявление вирусов с использованием животных наиболее целесообразно в тех случаях, когда удается воспроизвести в эксперименте типичную картину инфекционного заболевания или отдельные его проявления. Так, возбудители группы арбовирусов и Коксаки могут быть выявлены при заражении в мозг мышей-сосунков, гриппа — при заражении куриных эмбрионов или интраназальном введении исследуемого материала мышам.

3.Серологическая диагностика, основанная на реакции антиген – антитело, может быть использована для определения как тех, так и других, и играет роль в определении этиологии вирусной инфекции даже при отрицательных результатах выделения вируса. Для этих исследований необходимо взятие сыворотки крови в острый период болезни и в период реконвалесценции (парные сыворотки). Положительной реакция считается по крайней мере при 4-кратном нарастании титра антител. Известно, что большинство специфических антител относятся к классам IgG и IgM, которые синтезируются в различное время инфекционного процесса. При этом IgM антитела относятся к ранним, и тесты, используемые для их определения, применяются для ранней диагностики (достаточно исследовать одну сыворотку). Антитела класса IgG синтезируются позже и длительно сохраняются.Для типирования вирусов применяется РН - реакция нейтрализации, при группоспецифической диагностике, например, аденовирусной инфекции, используют реакцию связывания комплемента (РСК). Наиболее употребительнымий являются реакция торможения гемагглютинации (РТГА), РСК, РИФ, реакции пассивной и обратной пассивной гемагглютинации (РПГА, РОПГА), различные варианты ИФА, практически повсеместно заменившего равный ему по чувствительности РИА.

4. Молекулярно-генетический метод

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров.Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций (вирусы гепатитов, герпеса, цитомегалии, папилломы и др.)

Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

Непрямые методы диагностики (определение антител к возбудителю) — это серологические исследованя методом иммуноферментного анализа (ИФА) качественный и количественный анализ IgM, IgG, IgA.

Прямые методы: культура вируса, исследование антигена р24, ПЦР.

Непрямые методы: иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (ТИФА), иммуноблоттинг (WB, вестерн-блоттинг), непрямой иммунофлуо-ресцентный анализ (НИФА), метод радиоиммунопреципитации (РИП).

11.Методы культивирования вирусов: в культурах клеток, в курином эмбрионе, в организме лабораторных животных. Их сравнительная характеристика. Примеры вирусов

Основные методы культивирования вирусов.

1.В организме лабораторных животных.

2.В куриных эмбрионах.

3.В клеточных культурах.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.

12.Основные типы тканевых культур. Характеристика различных типов однослойных культур. Методы индикации и идентификации вирусов в культурах клеток.

Основные типы тканевых культур

7. Культуры фиксированных кусочков тканей (плазмированные культуры)

Кусочки измельченной ткани помещают в куриную плазму, образующую сгусток, в котором эти ткани фиксируются.

2. Однослойные культуры клеток

Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

3. Культуры суспензированных клеток

Суспензированная культуры - это культура,в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно находятся во взвешенном состоянии

Индикация, При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:

1. Цитоплазматическое действие вируса на культуру клеток

(ЦПД), то есть возникновение в ней видимых морфологических

дегенеративных изменений.

2. Приобретение зараженной культурой клеток способности

к гемадсорбции, т.е. к адсорбции эритроцитов на поверхности

клеточного слоя.

3. Образование в зараженной клеточной культуре под

плотным слоем специального агарового покрытия характерных

бляшек, являющихся "негативными колониями" вирусов.

Подавление процессов метаболизма в зараженной вирусом культуре клеток, выделяемое с помощью так называемой "цветной пробы " (цветной реакции).

Эти проявления действия вирусов в клеточных культурах и являются основными критериями, с помощью которых проводят индикацию вируса, то есть выявляют его наличие, а также устанавливают количественное содержание вируса, определяя его титр.

У различных вирусов преобладают те или иные проявления действия их на клеточные культуры, что используют для предварительной идентификации вируса.

Идентификация. Окончательная идентификация выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. После предварительного контакта вируса с сывороткой, этой смесью заражают культуру клеток и судят о наступившей нейтрализации, указывающей на соответствие вируса и сыворотки, по тем же критериям. Вирус, нейтрализованный специфической сывороткой:

1. Не оказывает цитопатического действия - происходит

реакция нейтрализации (торможения) цитопатического действия.

2. Не вызывает реакции гемадсорбции - наступает реакция

задержки гемадсорбции.

3. Не дает образования бляшек (или значительно

уменьшается их количество) - происходит реакция нейтрализации

образования бляшек.

4. Не вызывает подавления метаболизма клеток, что

выявляется в реакции нейтрализации по цветной пробе.

Таким путем проводят серологическую идентификацию вирусов, определяют их родовую и типовую принадлежность.

Выявление антител. По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации для определения неизвестных антител в сыворотке больного. В этом случае исследуемую сыворотку соединяют с известным вирусом, а затем вышеуказанными методами определяют - произошла ли реакция нейтрализации. Положительная реакция указывает на то, что антитела сыворотки соответствуют взятому в опыт известному вирусу.

Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток

Под цитопатическим действием понимают совокупность морфологических и функциональных (в том числе биохимических) изменений в клетках, возникающих под влиянием внедрившегося вируса.

Реакция клеток на заражение вирусом может проявляться в виде острой вирусной инфекции, латентной инфекции, трансформации клеток. Более выражена реакция клеток при острой вирусной инфекции. Предполагается, что основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведет к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые и вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД.

При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет: клетки отслаиваются от стекла и свободно плавают в культуралъной жидкости в виде бесструктурных зерен.

Цитопатическое действие вируса на монослой клеток учитывают по четырехкрестовой системе: "++-Н-" - полная гибель клеточной культуры; "+++" - клеточный слой отсутствует, но имеются единичные клетки, не пораженные вирусом; "++" -дегенеративные изменения наблюдаются у 50% клеточной культуры; "+" - дегенеративным изменениям подверглись отдельные клетки монослоя, главным образом в краевых участках.

Симпластообразование. При острой вирусной инфекции может наблюдаться и несколько иной тип цитопатического действия - образование гигантских многоядерных клеток -симпластов (или синцитиев). Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты лецитиназу, нейраминидазу и богатых лшщцами (главным образом парамиксовирусы). Ферменты воздействуют на оболочки клеток однослойной культуры, что приводит к слиянию клеток в громадные многоядерные синцитии.

Включения. К проявлению цитопатического действия вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть едиственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

Латентная вирусная инфекция клеточной культуры характеризуется репродукцией вируса при отсутствии выраженного цитопатического действия.

Трансформация клеток наступает при заражении клеточной культуры онкогенными вирусами, под действием которых клетки начинают безудержно делиться и располагаются не монослоем, а растут беспорядочно в несколько слоев. При заражении такой культурой животного, у него может возникнуть злокачественная опухоль.

Индикация вируса по его цитопатическому действию, С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральнуго жидкость, затем вносят но 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду (поддерживающую, без сыворотки) до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37°С, и ежедневно микр о скопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более).

Дегенеративные изменения клеточного слоя не менее, чем на два креста ("++") при отсутствии таковых в незараженной культуре указывают на наличие в исследуемом материале вируса.

Цитопатическое действие различных вирусов на клеточные культуры (даже, если брать различные типы культур) обладает определенной специфичностью Родственные вирусы обычно дают цитолатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдаленных по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД нередко можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус.

Так, для энтеровирусов (вирусы полиомиелита, Коксаки, ECHO) характерно ЦПД в виде однородной мелкозернистой деструкции клеток, клетки приобретают округленную форму, располагаются довольно равномерно. Для ЦПД аденовирусов типичным является превращение клеточного слоя в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда. Парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита дают цитопатический эффект в виде образования симплаотов.

Имеются и другие проявления цитопатического действия вирусов, не столь характерные.

Титрование вирусов по цитопатическому действию.

Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры (берут по 4 пробирки на каждое разведение). В остальном методика титрования вируса по ЦПД не отличается от вышеприведенной методики обнаружения вируса по ЦПД.

Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине зараженных культур (т.е. в 2 пробирках из 4 с данным разведением вируса). Титр вируса вычисляется по методу Рида и Менча. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД5о) в 1 мл. За одну ПДДзо принимают OJ мл вируссодержащего материала, разведенного до титра.

Идентификация выделенного вируса по нейтрализации ЦПД. Вирус ее содержащим материалом, подлежащим идентификации, обычно служит культуральная жидкость из пробирок с клеточной культурой, давших ЦПД при заражении исследуемым материалом.

Для постановки опыта культуральную жидкость (с определенной дозой ЦПД5о вируса) смешивают с равным объемом диагностической иммунной сыворотки (берут разведение сывортки 1:5 или 1:10). После, 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Обычно пробы культуральной жидкости проверяют одновременно с несколькими типовыми сыворотками. Опыт сопровождается несколькими контролями: I) контроль незараженной культуры; 2) контроль дозы вируса - клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте; 3) контроль культуры, зараженной смесью культуральной жидкости с нормальной сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем - обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, т.е. сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

Сходным образом проводят титрование вируснейтрализующих антител в сыворотке больного. Готовят двукратные последовательные разведения исследуемой сыворотки и смешивают каждое из них со стандартной дозой известного вируса (100, 1000 ЦПД50), после 1-2-часового контакта смесью заражают клеточные культуры.

Титром сыворотки называется то наибольшее разведение, которое полностью подавляет ЦПД вируса в половине взятых в опыт культур (т.е. в 2 пробирках из 4, на которых проверяют; каждое разведение сыворотки).

Реакция гемадсорбции

Гемадсорбцией называется способность культур клеток, зараженных некоторыми вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Впервые это явление было обнаружено в культуре клеток, зараженных вирусом гриппа. Позже было установлено, что гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы (например, орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы), эти же вирусы обладают способностью вызывать гемагтлютинацию -склеивание эритроцитов. Гемадсорбция и гемагглютинация имеют сходный механизм (см. главу 5). Приобретение способности к гемадсорбции связано в встраиванием в мембрану зараженных вирусом клеток (в участках будущего "почкования" вирусов) вирусспецифических белков - гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности зараженных клеток.

В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека О (I) группы.

Наиболее активными в реакции гемадсорбции являются эритроциты чувствительные к гемагглютинирующему действию данного вируса.

Обнаружение вируса в реакции гемадсорбции. Зараженные вирусом клетки приобретают способность к гемадсорбции задолго до возникновения в них цитопатических изменений, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для раннего обнаружения вирусов в зараженной культуре.

По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно. Латентную инфекцию культур клеток могут вызывать аденовирусы, парагриппозные, вирус герпеса и др.

Техника постановки реакции гемадсорбции._

Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом по описанной выше методике. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с зараженной культурой (иногда предварительно удалив среду) вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4%-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем.

Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависят от вида вируса. При постановке реакции с поксвирусами, вирусами клещевого энцефалита опыт проводят в течение 15-30 минут при комнатной температуре. При проведении реакции с орто- и парамиксовирусами достаточной является экспозиция в 3-5 минут.

Далее пробирки слегка встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания не ад сорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малым увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.

При положительной гемадсорбции скопления эритроцитов на клетках могут быть весьма характерными. Вирус гриппа дает гемадсорбцию островкового типа: парагриппозные вирусы -диффузного; для поксвирусов характерным является расположение эритроцитов вокруг клеток в виде венчика или ожерелья.

Реакция гемадсорбции наиболее часто применяется для раннего обнаружения парагриппозных вирусов в носоглоточных смывах больных. Реакцию применяют также и для титрования вирусов и выявления специфических антител.

Идентификация вирусов в реакциизадержки гелшдсорбции. Было обнаружено, что при добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно зараженной соответствующим вирусом, зараженные клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления, реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.

Реакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов.

Она применяется в двух направлениях:
1) для идентификации вирусов;
2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках.

Компоненты:
1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).
2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).
3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты.

Реакции нейтрализации ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных.

Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.

14.Методы индикации и идентификации вирусов.Реакция гемагглютинации вирусов (рга) и реакция торможения торможения гемагглютинации,сущность практическое применение.

Дата добавления: 2015-08-31