Метод сахарной нагрузки

Количественная оценка электрофореграмм.

Окраска электрофореграмм.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.

Ход работы

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Буферный раствор. 3. Хроматографическая бумага. 4. Краситель амидо черный 10 В. 5. Раствор уксусной кислоты (2%). 6. Раствор гидроксида натрия (0,1н).

Полоска хроматографической бумаги пропитывается буферным раствором, концы полоски опускаются в кюветы с буферным раствором, а в кюветы помещают электроды — катод и анод. В средней трети бумажной полоски поперек на полосу на линию старта наносят исследуемую сыворотку и включают электрический ток. Через определенное время ток выключают и бумажку подсушивают при 90⁰С (при этом белки подвергаются денатурации и фиксируются на бумаге). Далее фракции нужно проявить.

Фиксированные полосы помещают в кювету с краской (амидо черный 10 В) и оставляют там на 15–20 минут. Для удаления избытка краски бумажные полоски переносят в кювету с 2% раствором уксусной кислоты. Через 5–10 минут кислоту сливают и полоски заливают чистым раствором уксусной кислоты. В результате такой обработки синие пятна, соответствующие различным фракциям белков, отчетливо видны на белом фоне. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе.

В 5 пробирок наливают из бюретки по 5мл 0,1н. NаОН. Вырезают ножницами участки электрофореграммы, соответствующие каждой фракции, помещают в пронумерованные пробирки со щелочью. В качестве контроля берут неокрашенный участок бумажной полоски шириной 3–10 мм. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют на 30–60 минут для полного извлечения краски из бумаги. Затем определяют оптическую плотность каждого раствора на фотоэлектроколориметре (кювета 10 мм, красный светофильтр с длиной волны = 670 нм). Зная оптические плотности растворов, соответствующие каждой фракции, вычисляют сумму оптических плотностей всех фракций и выражают относительное содержание белка в каждой фракции. Например:

Е_альбум =, Е_{α1-глобул} =, Е_{α2-глобул} =, Е_{β-глобул} =, Е_{γ-глобул} =, Σ =.

% =, % =, % =, % =, % =.

Углубленное изучение углеводного обмена производится методом сахарной нагрузки, при котором определение глюкозы в крови проводят через определенные промежутки времени. Эти данные являются более ценными, чем однократное определение содержания глюкозы в крови. Они позволяют выявить скрытые формы диабета и нарушение гликогенобразовательной функции печени.

Показания для проведения теста на толерантность к глюкозе:

▪ Неоднозначные результаты однократных анализов крови натощак.

▪ Глюкозурия: панкреатическая и внепанкреатическая (первая связана с недостатком секреции или недостаточностью самого инсулина; внепанкреатическая глюкозурия развивается при поражении других органов внутренней секреции, ЦНС, при эмоциональном стрессе, заболеваниях почек, печени, избытке углеводов в диете, при беременности).

▪ Клинические признаки сахарного диабета или его осложнений при нормальной концентрации глюкозы крови натощак (скрытые формы диабета).

Дата добавления: 2017-02-01