Іммобілізовані ферменти

Більш широке використання ферментів до останнього часу стримувалося низкою причин, з яких найважливішими є:

· трудомісткість відділення ферментів від початкових компонентів і продуктів реакції після завершення процесу, внаслідок чого ферменти використовуються, як правило, одноразово;

· нестійкість ферментів за зберігання, а також різних впливів (головним чином теплових);

· трудомісткість очищення ферментів і отримання їх в достатньо активному вигляді.

Широкі перспективи відкрилися перед інженерною ензимологією в результаті створення нового типу біоорганічних каталізаторів, так званих іммобілізованих ферментів. Термін іммобілізовані ферменти узаконений порівняно нещодавно, у 1974 р. Т. Сандеремом і Д. Реєм, хоча ще у 1916 р. Дж. Нельсон і Е. Гріффі показали, що інвертаза, адсорбована на вугіллі або алюмогелі, зберігає свою каталітичну активність. Проте початок цілеспрямованих досліджень, орієнтованих на створення такого роду стабілізованих ферментних каталізаторів, відноситься до середини XXст., при цьому проводився широкий фронт робіт і за останні 30...35 років було досягнуто відчутних успіхів. Іммобілізація − це процес прикріплення ферментів до поверхні природних або синтетичних матеріалів, включення їх до полімерних матеріалів, порожнистих волокон і мембранних капсул, поперечного хімічного зшивання. Іммобілізацію також можна характеризувати як фізичне розподілення каталізатора і розчинника, під час якого молекули субстрату і продукту легко обмінюються між фазами.

Розподілення може бути досягнуто адсорбційним або ковалентним зв'язуванням ферменту з нерозчинними носіями або скріпленням окремих молекул ферменту з утворенням агрегатів. За іммобілізації ферментів відбувається стабілізація каталітичної активності, оскільки цей процес перешкоджає денатурації білків. Іммобілізований фермент, що має обмежену можливість для конформаційних перебудов, швидше ніж розчинний знаходить найкоротший шлях до функціонально активної конформації. Іммобілізовані ферменти набувають, окрім стабільності, окремих властивостей, не характерних для їх вільного стану, наприклад, можливість функціонувати в неводному середовищі, ширші зони оптимуму температури і рН. Іммобілізовані ферменти просторово роз'єднані на носієві. Це викликає утруднення міжмолекулярних взаємодій типу агрегації, які можуть привести до інактивації ферменту. При цьому фермент з розряду гомогенних каталізаторів переходить до розряду гетерогенних, тобто перебуває у фазі, не пов'язаній ні з початковим субстратом, ні з утворюваним продуктом. Це дозволяє організовувати на базі іммобілізованих ферментів різні ефективніші біотехнологічні процеси багаторазової періодичної, а також безперервної дії з використанням принципу взаємодії рухливої і нерухомої фаз.

Тривалість збереження каталітичної активності і ряд властивостей ферментів визначаються правильністю вибору носія, методу і умов проведення іммобілізації. Існує декілька принципово різних підходів, що дозволяють об'єднати фермент з носієм:

· адсорбційні методи;

· методи хімічного скріплення на поверхні;

· методи механічного включення або захоплення;

· методи хімічного приєднання (рис. 69)

Рис. 69. Основні методи іммобілізації ферментів:

А − абсорбція на великопористому носії; Б − ковалентне зв'язування; В − адсорбція; Г − поперечне зшивання; Д − включення у гель

Методи іммобілізації шляхом адсорбції засновані на фіксації ферменту на поверхні різних матеріалів − неорганічних (силікагель, пористе скло, кераміка, пісок, обпалена глина, гідроокиси титану, цирконію, заліза) і органічних (хітин, целюлоза, поліетилен, іонообмінні смоли, спінена гума, поліуретан із пористою структурою).Наскільки різноманітні матеріали, щовикористовуються для адсорбції ферментів, настільки різні механізми і міцність зв'язування ферменту із носієм. Характеризуючи ці зв'язки, можна говорити про широкий їх спектр, від простого обростання носія до утворення полярних, йонних і ковалентних зв'язків. Адсорбція − це найпростіший метод іммобілізації ферментів на поверхні нерозчинних носіїв.

Процедура іммобілізації полягає в змішуванні за певних умов ферменту з носієм і інкубації суміші. У подальшому за допомогою фільтрування і центрифугування здійснюють відокремлення нерозчинного компоненту суміші від розчинного. У процесі адсорбції ферменту на носієві за їхньої взаємодії виникають сольові зв'язки, а також інші слабкі взаємодії (водневі, ван-дер-ваальсові). Адсорбція − м'який метод іммобілізації, за якого вплив носія на активність ферменту мінімальний, тому, як правило, ферменти добре зберігають активність. Недолік даного методу − неміцність зв'язків. Тому за незначною зміною умов середовища (рН, температури, йонної сили, концентрації продукту) можлива десорбція ферменту з поверхні носія. Більш міцними є зв'язки, засновані на йонній взаємодії, коли адсорбція підтримується за певних значень рН і йонної сили розчину, що омиває фермент.

Методи хімічного зв'язування мають довгу історію і реалізуються в різних модифікаціях. Практично всі функціональні групи білків можуть бути використані для зв'язування каталізатора з носієм. Широке застосування знайшли реакції, що здійснюються за наявності водопоглинаючого агента, і викликають утворення пептидних зв'язків між аміногрупами ферменту і карбоксильними групами носія або, навпаки, − між карбоксильними групами ферменту і аміногрупами носія.

Як водопоглинаючий агент використовується дициклогексил-карбодиімід, зшиваючим агентом може бути бромціан. Можливе проведення скріплення без участі зшиваючих агентів. Перспективним підходом у розвитку даного методу є використання прищеплених полімерів як носіїв. Прищеплюючи до поверхні полімерного матеріалу бокові гілки, вдається регулювати його властивості і впливати на реакційну здатність за рахунок створення на поверхні носія мікроспоруд, оптимальних для стабільного функціонування біокаталізатора. Приклад такого підходу − застосування поліетилену з прищепленими полівініловим спиртом або поліакриловою кислотою. З метою зниження дифузійного утруднення між субстратом і ферментом, а також для полегшення відтоку продуктів, що утворюються, за іммобілізації можна виводити фермент із мікроспоруди молекули носія. Фермент приєднують до поверхні носія через деяку хімічну послідовність певної довжини, так званий спейсер.

Іммобілізація шляхом хімічного зшивання ферменту з носієм характеризується високою ефективністю і міцністю зв'язку. Для запобігання зниженню каталітичної активності ферменту місце зшивання віддаляють від активного центру каталізатора і приєднання здійснюють не по білковій частині молекули, а по вуглеводній.

Одним із найбільш ефективних методів іммобілізації з утворенням хімічних зв'язків вважають утворення ковалентних зв'язків між молекулою носія і каталізатором. Як правило, для ковалентного приєднання носій необхідно заздалегідь активувати (активацію афінних носіїв проводять, наприклад, бромціаном). Простішим, таким, що не потребує попередньої модифікації носія, і швидким за іммобілізації в простих умовах є металохелатний метод. Він полягає в іммобілізації ферментів на носіях з полімерів гідроксидів металів (титану, цирконію, олова, заліза). Гідроксильні групи витісняються з координаційної сфери того або іншого металу функціональними групами ферменту, в результаті між носієм і ферментом виникає координаційний або ковалентний зв'язок. Успіх методу визначається за таких умов: у молекулі ферменту повинні бути групи, що віграють роль лігандів і здатні стерично контактувати з атомами титану; дані групи повинні бути віддалені від активного центру. Метод застосовують у різних варіантах, з використанням органічних і неорганічних носіїв, включаючи йонообмінні носії. Природа комплексу може суттєво впливати на активність і операційну стабільність іммобілізованого ферменту.

Порівняно новим різновидом металохелатного методу є іммобілізація ферментів на основі гідроксидів перехідних металів, головним чином титану і цирконію. Молекули ферменту закріплюються на поверхні носія шляхом утворення хелатів. Для реалізації даного методу, окрім фермента, необхідна наявність лише одного реагента, власне гідроксиду металу. Недоліком методів іммобілізації на основі фізичної адсорбції або ковалентного приєднання є необхідність використання достатньо великих кількостей каталізатора. Більше того, хімічна модифікація, якої піддаються ферменти в процесі іммобілізації може суттєво знижувати їх каталітичну активність. Уникнути цього можливо за використання методів іммобілізації ферментів шляхом введення в полімерну структуру.

Як полімерні носії застосовують природні й синтетичні матеріали (альгінат, желатин, карагінан, колаген, хітин, целюлоза, поліакриламід, фоточутливі полімери). Розчин ферменту змішують з розчином мономерів носія. У подальшому створюють умови для процесу полімеризації, в ході якої відбувається механічне введення фермента до структури носія. Важливим моментом є рівномірність розподілу молекул ферменту за об'ємом носія і однорідність отримуваних агрегатів. Техніка введення залежить від природи і властивостей використаного матеріалу, а утворювані при цьому біосистеми мають вид гранул, волокон, полімерних сіток, плівок тощо.

Іммобілізація в поліакриламідний гель (ПААГ), який найчастіше використовується для цих цілей, полягає у внесенні розчину ферменту до розчину мономера. У подальшому в підібраних умовах швидко формується гель у вигляді блоку. Монолітний гель подрібнюють, надаючи часткам форми кубиків бажаного розміру. За використання желатину або агар-агару спочатку підігрівають їх розчини, потім охолоджують і вносять до ферменту. У процесі подальшого охолоджування відбувається формування гелю. Полімеризація альгінату відбувається за наявності деяких катіонів. Тому на першому етапі змішують розчини ферменту і мономерів цих полісахаридів, далі суміш за допомогою дозуючого пристрою вносять до розчину, що містить йони Са²⁺ або Ва²⁺ (для альгінату) або А1³⁺, Fe, К⁺ або Mo⁺ (для карагінану), при цьому утворюються сферичні полімерні частинки у вигляді гранул.

Зручною для використання є іммобілізація ферментів методом інкапсулювання. У цьому методі головним є не створення фізичних або хімічних сил, необхідних для зв'язування каталізатора з носієм, а утримання розчину, що оточує фермент. У процесі інкапсулювання іммобілізуються не окремі молекули ферменту, а початковий розчин, що містить фермент. При використанні методу іммобілізації стосовно ферментів найчастіше застосовують коацервацію і міжфазову полімеризацію. Перший прийом реалізується без хімічних реакцій і включає фазове розподілення колоїдних часток полімеру, що асоціюють навколо маленьких водних краплин і утворюють у подальшому безперервну мембрану. Як полімерні матеріали при цьому використовують нітрат або ацетат целюлози, бутадієновий каучук. При міжфазовій полімеризації для утворення напівпроникної мембрани один з реагентів є у водній, інший − в органічній фазі; на межі розділу фаз відбувається реакція полімеризації і навколо диспергованих в органічній фазі краплин утворюється шар полімеру. За допомогою цього методу можуть бути отримані мембрани з поліуретану або епоксидних смол. Напівпроникні мембрани, що покривають розчин з ферментом, можуть бути виготовлені з різних матеріалів (полістиролу, поліакрилату, поліуретану, поліефірів, ліпідів, полікарбонатів й ін.). Варіюючи матеріали для отримання напівпроникної мембрани, можна здійснювати контроль розмірів молекул. Наприклад, великі за розмірами молекули ферментів утримуються всередині капсули, а дрібніші молекули вихідних субстратів і продуктів, що синтезуються, можуть вільно дифундувати через мембрану. Діаметр мікросфер буває від декількох мікрон до декількох тисяч мікрон за товщини мембран від сотень ангстрем до декількох мікрон. Безумовною перевагою мікрокапсулювання є велика площа поверхні, яка припадає на одиницю активності іммобілізованого ферменту, що дозволяє використовувати високі концентрації ферментів у початковому розчині й досягати високої ефективності їх дії. При цьому можливо також надавати ферменту здатність функціонування у неводному середовищі й отримувати великі виходи цільового продукту за високого ступеня чистоти.

До інкапсулювання близький метод обернених міцел. Фермент вводять у замкнуту структуру поверхнево-активної речовини (ліпід, детергент), що утримує мікроскопічну краплину води. Він функціонує на межі розподілу двох фаз: органічної, такої, що перебуває в біореакторі, й водної, що введена в обернену міцелу.

Суттєвий інтерес викликає спосіб введення ферментів у порожнисті волокна. Застосовують волокна, що виготовлені з природних або синтетичних полімерних матеріалів. Розчин ферменту вводять до внутрішнього об'єму порожнистих волокон і потім «запечатують» волокно з обох кінців. Фермент у порожнині волокон не зазнає будь-яких хімічних модифікацій, тому зберігає свою активність і властивості.

Іммобілізація методом поперечних зшивань (або хімічного приєднання) полягає в хімічному зв'язуванні молекул ферментів між собою шляхом утворення поперечних зшивань. Для цього застосовують різні агенти, що несуть дві і більше реакційноздатні групи, які здійснюють поперечне зшивання ферментів.

Метод відрізняється простотою реалізації і дозволяє проводити зшивання різних за структурою ферментів, а також ферментів з цілими клітинами. Однак, часто при зшиванні може відбуватися суттєва зміна зниження активності каталізатора.

Таким чином, методи іммобілізації досить різноманітні, причому є можливість використання їх у поєднанні. Наприклад, адсорбцію на носієві з інкапсулюванням, введення до структури гелю та адсорбцію і так далі. Методи, що розглядалися, застосовуються не лише для іммобілізації ферментів, а й і для інших біокаталізаторів − цілих клітин, клітинних органел, антитіл, антигенів та ін. Жоден з описаних методів не є універсальним, і для кожного типу каталізаторів існують свої переважні методи. Ферменти іммобілізують різними адсорбційними методами або методом поперечних зшивань. Кращим методом для іммобілізації цілих клітин є введення до полімерних структур.

Окрім створення стійких біокаталітичних ферментних систем, найважливішим завданням інженерної ензимології є вивчення фізико-хімічних властивостей даних систем і розробка наукових основ їх функціонування та застосування.

Дата добавления: 2017-02-01