Клеток растений

Теоретические и методические принципы культивирования

История развития метода культуры клеток и тканей растений.

Лекция 2

Цель: ознакомить студентов с принципами культивирования клеток растений, остановиться подробно на истории развития метода культуры клеток и тканей растений, показать перспективность и скрытый потенциал растительной биотехнологии.

План лекции:

1. История развития метода культуры клеток и тканей растений

2. Перспективы развития биотехнологии в Республике Казахстан

3. Основные принципы культивирования клеток растений

1 Попытки культивировать изолированные клетки, ткани растений делались давно, и в истории развития этого метода можно выделить несколько этапов.

1 этап (1892-1902 гг.) связан с именами таких немецких исследователей, как Хаберландт, Фехтинг, Рехингер. Они пытались культивировать в растворе сахарозы различные растительные ткани. Для сегментов стеблей одуванчика и тополя был изучен первичный каллус. Не достигнув положительных результатов эти исследователи высказали ряд идей и гипотез, которые подтвердились позже. Так, Хаберландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой растительной клетки, т.е. способности клеток реализовывать свой потенциал развития и давать начало образованию целого растения при определенных условиях культивирования.

2 этап (1902-1922 гг.) ознаменовался созданием первых питательных сред для культивирования тканей животных. Эти среды были природного происхождения и содержали плазму крови и зародышевую жидкость. Попытки вырастить изолированные растительные ткани на искусственных питательных средах, содержащих растительные экстракты, оказались неудачными, т.к. использовались мало подходящие для проявления ростовой активности клетки и ткани высших растений.

3 этап (1922-1932 гг.) американский ученый Робинс и немецкий ученый Коте показали возможность культивирования на твердых питательных средах меристем кончиков корня томатов и кукурузы. Однако, через определенное время растительные ткани погибали.

4 этап (1932-1940 гг.) французский ученый Р. Готре показал возможность долгого культивирования в условиях in vitro растительных тканей за счет периодического пересеивания их на свежую питательную среду. Впоследствии с помощью этого метода многие растения были введены в культуру.

5 этап (1940-1960 гг.) с открытием в 1955 г. нового класса фитогормонов – цитокининов, была получена возможность стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевины паренхимы табака, лишенный проводящих пучков и камбия в зависимости от концентрации и соотношения стимуляторов роста можно было усиливать деление клеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез. Было установлено положительное действие натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов морфогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий.

6 этап (1960-1975 гг.) профессор Ноттингемского университета Э.Коккинг разработал ферментативный метод получения изолированных протопластов из корней и плодов томата и культивировать их в контролируемых условиях. Его сотрудником Пауэром было осуществлено искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию соматических гибридов. Французский ученый Ж. Морель разработал метод микроразмножения растений в условиях in vitro с использованием меристемиды культуры и применял его для получения оздоровленного посадочного материала орхидей.

7 этап (1975 г. по настоящее время) продолжается быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов, разрабатываются методы электрослияния изолированных протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции, методы получения гаплоидных растений, совершенствуется метод глубинного культивирования клеток с использованием изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti- и Ri- плазмид Agrobacterium tumefaciens и A.rhizogenes. С помощью методов генной инженерии разработан эффективный метод переноса генов для двудольных растений. Таким образом, за последние десятилетия был сделан большой шаг вперед в раз-витии технических приемов работы с изолированными тканями и клетками растений. Однако объектом исследования, как правило, служили однодольные и двудольные травянистые растения и в редких случаях – древесные.

2 Приоритет развития биотехнологических производств, ориентированных на нужды здравоохранения, определен Государственной программой развития фармацевтической и медицинской промышленности РК, утвержденной Указом Президента РК от 20.08.1997 года, № 3621.В Республике Казахстан имеется огромный научный и производственный потенциал для развития медицинской биотехнологии. Это ведущие научно-исследовательские институты и предприятия республики, такие как Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина (ИМБиБ), Научно-исследовательский сельскохозяйственный институт (НИСХИ), Институт физиологии, генетики и биоинженерии растений (ИФГБР), Алматинский биокомбинат, ОАО «Биомедпрепарат», ОАО «Биопрепарат», ОАО «Прогресс», Институт фармацевтической биотехнологии, Центральная лаборатория биологических исследований лекарственных соединений (ЦЛБИЛС), Институт микробиологии и вирусологии, Институт питания, Казахский государственный национальный университет им. аль-Фараби, Институт общей генетики и цитологии, Институт фитохимии. В период с 1993 по 2000 годы в Республике Казахстан основные прикладные исследования в области биотехнологии осуществлялись в рамках Республиканской целевой научно-технической программы (РЦНТП) «Использование методов биотехнологии и генной инженерии в медицине, сельском хозяйстве и промышленности», в рамках которой разработаны антигрибковый препарат «Розеофунгин», ранозаживляющее средство «Имозимаза», разработаны технологии получения экзополисахарида полимиксана в качестве мазевой основы, фермента декстраназы и пробиотика бифидумбактерина; получены лекарственные формы препаратов на основе первого отечественного противогрибкового антибиотика розеофунгина и фермента протосубтилин; создана везикулярная система для транспорта лекарств- СИТРАЛ; разработаны тест-системы для определения хориогонадотропина, гистамина и ВИЧ; разработаны методы получения и культивирования b-клеток поджелудочной железы кроликов и телят и их трансплантации интраокулярным и прямым способами в организм больного сахарным диабетом. В настоящее время в Институте фармацевтической биотехнологии совместно с ОАО «Биопрепарат» налаживается промышленный выпуск протеолитического иммобилизированного фермента «Имозимаза», b-каротина, антибиотиков низина и тилозина, а также разрабатывается экспресс-метод диагностики ВИЧ.Совместно с Институтом фитохимии проводятся исследования по полупромышленному культивированию клеток полыни, являющейся продуцентом сесквитерпеного лактона арглабина, на основе которого разработан одноименный противоопухолевый препарат.

В научно-исследовательском ельскохозяйственном институте получены культуры гепатоцитов с высокой функциональной активностью. Гепатоциты имеют все морфофункциональные свойства, характерные для интактной печени, что доказано цитологическими и биохимическими исследованиями.

В институте молекулярной биологии и биохимии разработана новая лекарственная форма на основе фосфатидитинозитольного комплекса.

Значительным потенциалом обладают лаборатории, организованные в составе Национального центра по биотехнологии МОН РК. Уровень подготовки персонала и оснащение позволяют проводить сложные исследования по разработке лекарственных средств и диагностикумов на основе моноклональных антител. Под руководством НЦБ МОН РК осуществляется сбор, пополнение и поддержание микроорганизмов-продуцентов ценных биологически активных веществ. Существуют аппараты для культивирования микроорганизмов и растительных клеток Ак-203 и Ак-210, предназначенные для аэробного культивирования в жидких средах непатогенных микроорганизмов. Процесс культивирования в аппарате может проводиться как в периодическом, так и непрерывном режимах. Области применения: изучение биохимии и физиологии микроорганизмов; микробиологическое производство медицинских препаратов; пищевая промышленность; микробиологическая очистка сточных вод. Устройство: каждый аппарат Ак-203 и Ак-210 состоит из четырех основных частей: биохимического прибора, содержащего ферментер и вспомогательные устройства, связанные с ним гидравлическими, пневматическими и механическими связями; прибора измерения, включающего в себя измерители рН и рО₂; прибора регулирования, в состав которого входят электронные блоки регулирования температуры жидкости, скорости вращения мешалки, задания расхода жидкости по четырем каналам и регулирования рН; автоматического потенциометра для регистрации параметров культивирования микроорганизмов. В состав каждого аппарата может быть дополнительно введен контроллер, осуществляющий связь аппаратов с компьютером типа IBM PC/АТ и программная система Ферм Сервис, что обеспечивает:

- автоматическое ведение процессов культивирования микроорганизмов;

- возможность корректного вмешательства оператора в процесс культивирования; протоколирование хода процесса с переключаемыми интервалами записи на принтере и жестком диске;

- графическое отображение параметров процесса и состояния аппаратуры комплекса;

- программирование процессов культивирования на специализированном языке Прок, существенно упрощающем задачу программирования для пользователя;

- обработку данных и управление процессом культивирования по алгоритмам заказчика.

В целях дальнейшего развития биотехнологии необходимо осуществлять творческие контакты с учеными международных биотехнологических центров и других научных учреждений развитых и развивающихся стран – США, Великобритании, Франции, Германии, Японии, Италии, Индии, Китая и других, а также обеспечить постоянную и эффективную государственную поддержку этих исследований, что позволит в дальнейшем выйти в области биотехнологии и особенно в биоинженерии на мировой уровень. По клеточной биотехнологии результаты исследований ученых нашей страны уже сегодня не уступают зарубежным, а по ряду важных направлений и превосходят их.

3 Культурой клеток растений (обобщенно) называется выращивание отдельных клеток, тканей и органов растений на искусственной питательной среде в асептических условиях. Кусочек простерилизованной растительной ткани помещают в чашку Петри или пробирку на агаризованную питательную среду. После этого в ткани начинается интенсивное деление клеток. Клеточная масса быстро разрастается, образуя каллус. Каллус - это особый тип ткани, представляющий собой скопления недифференцированных клеток. Если затем кусочки этого каллуса периодически пересаживать на свежую питательную среду, то они могут расти неограниченно долго. Термин «культура клеток растений» превратился в широкое и удобное понятие, охватывающее все виды работы in vitro с культурами изолированных клеток (даже части клеток - протопластов), тканей, органов, зародышей и целых растений-регенерантов. Термин in vitro (лат. «в стекле», «в склянке») используется для описания условий протекания процессов в стерильной искусственной окружающей среде: термин in vivo (лат.- «на живом») применяют по отношению к естественным нестерильным условиям протекания процессов жизнедеятельности в организме.Термин растение-регенерант означает асептически полученное растение с развитыми корнями и побегами, сформировавшееся в культуре, то есть in vitro.Теоретически любая живая растительная клетка потенциально способна развиваться в организм, из которого была изолирована и культивировалась в определенных условиях. Это свойство называется тотипотентностью. Тотипотентность (от лат. totus – «весь», «целый» и potential – «сила») – свойство клеток в полной мере реализовать присущую им генетическую информацию, обеспечивающую их дифференцировку и дальнейшее развитие до целого организма. Обычно универсальной тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетки растений и животных. Что касается соматических клеток, тотипотентностью обладают только клетки растений, и то преимущественно в условиях in vitro. Культивируемые клетки животных лишены тотипотентности. Одним из направлений совершенствования метода культуры тканей был поиск возможностей выращивания одиночных клеток, результатом которого явилась разработка метода получения и выращивания клеточных суспензий. Культура клеток, или суспензионная культура, - это выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание. В Алма-Ате работы с культурой тканей начались в 1975 г. в Главном ботаническом саду, а затем получили развитие в Институте молекулярной биологии и биохимии, Институте ботаники, университете им. аль-Фараби. Основателями школы биотехнологии в Казахстане являются М. Айтхожин и И. Рахимбаев. Метод культуры клеток, тканей и органов является в н.в. общепризнанным и широкоприменяется во всем мире для решения фундаментальных и прикладных вопросов биологии растений. Исследования и разработки в биологии в последние 20 лет привели к формированию и развитию самостоятельной области знаний – биотехнологии. Биотехнология – это отрасль науки и производства, использующая биологические системы и процессы для производства экономически важных веществ и продуктов. Для этого используются микроорганизмы, культивируемые клетки растений и животных, ферментные системы, искусственные формы жизни, созданные методами клеточной и генной инженерии. На основе культивируемых клеток и тканей высших растений создаются перспективные, принципиально новые технологии для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства. Таким образом, культура клеток растений из лабораторного метода превратилась в теоретическую и технологическую основу новой отрасли промышленности – биотехнологии растений.

Контрольные вопросы:

1. Перспективы развития биотехнологии в Казахстане.

2. Что такое культура клеток растений.

3. Что такое тотипотентность? Кому принадлежит идея тотипотентности?

4. Что называется каллусом?

5. Какие ученые внесли существенный вклад в развитие метода культуры клеток?

Дата добавления: 2014-01-04