Методы растительной биотехнологии

Лекция 12

Цель: изложить наиболее общие сведения о том, что биотехнологические методы, основанные на культивировании клеток вне организма, на искусственных питательных средах в регулируемых асептических условиях, оказывают революционизирующее воздействие на селекционный процесс.

План лекции:

1. Клеточная селекция.

2. Клеточная и генетическая инженерия.

1 Клеточная селекция основана на высокой изменчивости популяции соматических клеток, усилении изменчивости с помощью различных мутагенов и на разработке селективных систем, позволяющих выявить и отобрать генетически измененные клоны клеток (мутантные, рекомбинантные и др.). Благодаря свойству тотипотентности из этих клеток регенерируют целые растения.Спонтанные мутации в популяции клеток наблюдаются редко, поэтому для повышения частоты мутаций используют индуцированный мутагенез. Получение мутантных форм при использовании селекции на клеточном уровне складывается из следующих этапов:

1) обработка мутагеном суспензии клеток и протопластов;

2) перенесение суспензии в селективные условия;

3) выделение развивающихся колоний;

4) отбор измененных резистентных к селективному фактору клонов;

5) индукции органогенеза;

6) регенерация измененных растений.

Методом клеточной селекции получены: линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу; линии картофеля: резистентные к фитофторе; растения табака, устойчивые к вирусу табачной мозаики. В культуре клеток получены мутанты с повышенным синтезом незаменимых аминокислот. Так отобраны штампы клеток моркови и табака, синтезирующие в 20-30 раз больше свободного триптофана по сравнению с исходными родительскими культурами. Этим способом получен целый ряд клеточных линий картофеля, моркови, риса, способных к сверхсинтезу лизина, метионина, пролина, фенилаланина, глицина. Это реальный путь создания растений с повышенным содержанием аминокислот, особенно незаменимых. Используя различные селективные системы, можно вести направленную селекцию по различным хозяйственно-ценным признакам, как то устойчивость к гербицидам, болезням, к различным стрессовым воздействиям (засоление, затопление, низкие и высокие температуры и др.).

Для получения мутантов в каждом случае необходимо разработать схему селекции и доказать генетическую природу измененных клеточных линий. Полученные изменения не всегда бывают связаны с мутациями, а могут носить модификационный характер и не наследоваться. Доказательством мутации является совокупность следующих критериев:

1) частота спонтанно измененных клеток должна быть низкая;

2) она значительно повышается при использовании мутагенов;

3) измененные клетки способны делиться и длительно расти;

4) стабильность измененного признака сохраняется и при отсутствии селективного давления;

5) обнаруживается продукт измененного гена (морфологические и биохимические маркеры).

Эффективность мутагена в культуре тканей повышается на гаплоидном уровне благодаря проявлению всех рецессивных мутаций в ранних поколениях, а также в культуре протопластов из-за их выравненности при изолировании из однородных тканей. Особенно перспективным источником выделения разнообразных мутаций являются протопласты гаплоидных растений.

Мутагенез и клеточная селекция как в случае соматических, так и половых клеток являются эффективными способами получения генетически измененных форм и новых сортов растений.

В результате генетической изменчивости in vitro возникают сомаклональные варианты – растения, отклоняющиеся от родительского типа. Сомаклональная вариабельность имеет несколько причин: перемещение подвижных генетических элементов, инверсии, транслокации, делеции, генные перестройки, связанные с дифференцировкой, соматический кроссинговер. Наследственная изменчивость в культуре клеток может иметь не только генетическую, но и эпигенетическую природу, то есть возникает вследствие изменения действия генов. Особый интерес представляют сомаклональные варианты злаков как источник получения ценных генотипов. Получены линии пшеницы, ячменя, риса, варьирующие по таким очень консервативным признакам, как высота рас-

тений, длина остей, окраска зерна, форма колоса, электрофоретические спектры запасных белков.

Сомаклональные варианты успешно используются как эффективный источник изменчивости для улучшения сортов сельскохозяйственных культур.

2 Основной задачей клеточной инженерии является конструирование новых форм растений с желаемыми признаками. Перспективный метод получения дальнородственных гибридов основывается на новой экспериментальной технике – парасексуальной гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Исследования по соматической гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Исследования по соматической гибридизации растений идут по трем основным направлениям:

1. изучение и реконструкция плазмагенов (генетический материал, локализованный вне ядра);

2. исследования по гибридизации клеток филогенетически отдаленных видов растений;

3. получение с помощью слияния протопластов соматических гибридов, представляющих практический интерес для селекции.

Основные различия соматической гибридизации от полового скрещивания заключается в следующем. Во-первых, с помощью половой гибридизации могут скрещиваться только растительные формы с нормальным морфогенезом и гаметогенезом. Презиготическую несовместимость можно преодолеть с помощью метода слияния протопластов. Во-вторых, половой процесс симметричен, то есть гаметы привносят в зиготу равные наборы ядерного генетического материала от обоих родителей. Продукты же слияния протопластов часто являются асимметричными гибридами, представляющими ценные формы, содержащие весь хромосомный набор культурного вида и лишь несколько хромосом или генов дикого родителя. В-третьих, внеядерный генетический материал у большинства растений при половом скрещивании наследуется строго однородительски – по материнской линии. Слияние протопластов позволяет получать уникальные сочетания митохондриальных и хлоропластных генов. И, наконец, четвертое отличие заключается в том, что половая гибридизация возможна только между филогенетически близкими видами растений. При соматической гибридизации возможно получение гибридов филогенетически отдаленных форм, которые обычным путем скрестить невозможно.

Слияние протопластов начинается с установления контакта (адгезии) между плазмалеммами соседних протопластов. Одновременно происходит изменение свойств мембран, приводящие к их слиянию. Расширение локальных цитоплазматических мостиков приводит к объединению цитоплазм с образованием гибридных клеток – цибридов.

Для формирования из гибридных протопластов растений, протопласты необходимо культивировать, чтобы они могли делиться и образовывать каллус, из которого впоследствии может регенерировать целое растение. Возрастает количество видов, для которых удалось провести весь цикл «растение – протопласты-каллус-растение».

Одним из важнейших моментов при проведении соматической гибридизации является отделение образовавшихся гибридных клеток от родительских. Селекция парасексуальных гибридов может проводиться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации растений. Селекция на стадии регенерации растений имеет ряд существенных недостатков, осложняющих такой отбор:

1) нет уверенности, что все гибридные растения не являются потомками единственной гибридной клетки;

2) длительное время, требуемое для селекции регенерантов;

3) большая трудоемкость.

В связи с этим, разрабатываются методы отбора соматических гибридов на клеточном уровне.

Наиболее распространенными являются методами:

1) механической изоляции;

2) генетической комплементации;

3) физиологической комплементации;

4) физического обогащения.

В популяции растительных клеток in vitro после их слияния могут иметь место различные нежелательные генетические изменения (полиплоидия, хромосомные перестройки, различные мутации), приводящие к появлению форм, фенотипически сходных с гибридными. Кроме того, агрегация исходных родительских клеток может привести к образованию химерных тканей (растений). В связи с этим, отобранные формы соматических гибридов должны подвергаться дополнительным анализом для проверки их гибридности. Гибридологический анализ позволяет проводить оценку потомства F₁ после самоопыления. Цитогенетический анализ основан на изучении числа и морфологии хромосом гибридных и родительских клеток. Более информативен метод дифференциального окрашивания хромосом. Цитогенетический анализ наиболее доказателен для дальнеродственных комбинаций- межсемейственных и метрибных.

Определение ферментативной активности и изучение спектра изоферментов позволяет выявить гибридную природу изучаемого материала. При этом в спектрах изоферментов гибрида должны совмещаться зоны, характерные для каждого из родителей. Большое значение имеет физиологическая стабильность различных форм изоферментов в зависимости от дифференцировки используемых для анализа клеток.

Анализ белка «Фракция 1». Этот белок локализован в хлоропластах и представляет собой фермент рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазу с оксигенной активностью и состоит из большой и малой субъединиц. Полипептидный состав обеих субъединиц различен у разных видов растений, поэтому этот белок является маркером при изучении межвидовых гибридов. Малая субъединица кодируется ядерным геномом и наследуется двуродительски. Большая субъединица наследуется однородительски (матерински) и кодируется пластомом. Анализ белка позволяет получить доказательство гибридности материала и исключить химеризм. Рестриктный анализ ДНК органелл. Анализ ДНК органелл с помощью рестриктаз является точным методом определения гибридности по

цитоплазмону. Рестриктные спектры, получаемые в результате электрофореза видоспецифичны и могут быть использованы для характеристики ДНК органелл.

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Применяют как ДНК-ДНК, так и ДНК-РНК-гибридизацию. Степень молекулярной гибридизуемости используется для характеристики систематического и филогенетического родства видов. Метод молекулярной гибридизации перспективен при изучении природы парасексуальных гибридов, особенно гибридов филогенетически отдаленных видов. В случае, когда хромосомный анализ не в состоянии выявить наличие в клетках гибридов хромосомного материала одного из родителей, наиболее подходящим методом для анализа гибридов является именно метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.

Фенотипическая изменчивость, наблюдаемая у соматических гибридов, является отражением тех генетических явлений, которые происходят до регенерации и указывают на следующие 4 источника изменчивости:

1) ядерная несовместимость;

2) межгеномная митотическая рекомбинация;

3) сомаклональная изменчивость;

4) органоидное расщепление.

Существует следующие ограничения, мешающие полному успеху метода соматической гибридизации:

1) применение этого метода требует эффективной регенерации растений из протопластов;

2) соматические гибриды не поддаются половому размножению, все межвидовые соматические гибриды являются стерильными;

3) для того, чтобы перенести полезные гены из диких видов в культурные, необходимо осуществить межгеномную рекомбинацию или хромосомные замещения между двумя видами;

4) при слиянии протопластов получаются растения с суммированным числом хромосом. Однако быстрый прогресс в совершенствовании методов клеточной инженерии позволяет надеяться, что соматическая гибридизация как новая биотехнология станет основной в селекции для получения жизнеспособных гибридов нескрещивающихся видов растений.

Реконструкция клетки является еще одним бурно развивающимся направлением клеточной инженерии. Речь идет о сборке совершенно новой клетки за счет объединения (слияния) изолированных клеточных фрагментов друг с другом или с целыми клетками. В результате такой реконструкции можно создать клетку, ранее в природе не существовавшую. Однако многие проблемы, стоящие на пути исследований в данном направлении, связаны с ограниченным числом подходящих методик фрагментации и выделения гомогенных популяций интактных клеточных фрагментов.

Существует ряд методик по введению чужеродных хлоропластов в изолированные протопласты. Одна из методик предусматривает последовательное центрифугирование протопластов и пластид в 0,03 % растворе лизоцима, который обладает модифицирующим действием на мембрану. Частота проникновения чужеродных органелл в протопласты в данном случае составляет 0,5 %. Другой метод заключается в том, что изолированные одиночные клетки инкубируют с ферментом целлюлазой. После проявления первых протопластов клетки переносят в суспензию хлоропластов в 2 % растворе целлюлазы и 0,2 М NaNO₃ при рН -5,4. С помощью этого метода проведено успешное включение в протопласты функционально активных хлоропластов с дальнейшей регенерацией целых растений. Осуществлена пересадка пластид черного паслена, несущих гены, контролирующие устойчивость к атразину, культурному картофелю. Анализ хлоропластной ДНК, устойчивых к атразину растений-регенерантов картофеля показал, что хлоропласты этих линий произошли от паслена.

Перенос высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растений. Среди большого разнообразия генетически измененных форм растений, образовавшихся из слившихся протопластов, встречаются формы, содержащие пластиды одного родителя, а митохондрии другого, и наоборот.

Новым направлением клеточной инженерии растений является создание необычных биологических систем путем введения микроорганизмов в популяцию культивируемых клеток. Создание таких ассоциаций представляет интерес для решения следующих задач:

1) экспериментальной проверки теории эндосимбиотического происхождения эукариотической клетки в процессе эволюции;

2) моделирования природных симбиотических отношений растений микроорганизмов;

3) повышения продуктивности культивируемых растительных клеток;

4) получения растений с новыми свойствами;

5) изучения различных аспектов взаимодействия растения-хозяина и патогена.

Получение искусственных ассоциаций межклеточного и внутриклеточного типа на основе культивируемых клеток или изолированных протопластов с микроорганизмами является одним из новых способов модификации растительной клетки. Довольно перспективным является получение ассоциаций культур клеток растений с микроорганизмами, способными к фиксации молекулярного азота атмосферы. Способность к формированию азотфиксирующих симбиотических систем приобрели определенные группы высших растений и микроорганизмов. В связи с этим вопрос о повышении способности к вступлению в такие симбиотические ассоциации для большинства растений имеет важное экономическое значение и может быть решен методами клеточной инженерии.

Следовательно, становится возможным конструирование клеток с новыми свойствами. Реконструированные клетки, происходящие из ядра и цитоплазмы разного происхождения, являются удобными экспериментальными моделями для решения таких важных биологических проблем, как дифференцировка, старение клеток, цитоплазматическая наследственность. Гибриды растений с генетически реконструированной цитоплазмой представляют собой весьма ценный материал для оценки влияния двух цитоплазматических генофоров на различные практически значимые признаки возделываемых культур.

Генетическая инженерия как способ переноса новых генов становится эффективным инструментом селекции культурных растений. Чтобы настроить в хромосому нужный структурный ген, требуется вектор-нуклеотидная последовательность, способная включаться в ДНК, не нарушая ее целостности. Вектор должен отвечать следующим требованиям:

а) должен автономно реплицироваться;

б) иметь маркеры, по которым легко можно обнаружить трансформированные клетки;

в) введение чужеродной ДНК не должно нарушать функций генома.

В поисках вектора ученые, в первую очередь, обратили внимание на плазмиды фитопатогенных бактерий, в частности, плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Эта почвенная бактерия вызывает образование опухолей (корончатых галлов) в области корневой шейки растения. Бактерия вводит в растительную клетку агент, индуцирующий опухоль. Этим агентом является участок Т-плазмиды, так называемая Т-ДНК, которая несет гены, ответственные за синтез опинов. В здоровых растениях опины не обнаруживаются, они начинают синтезироваться в инфицированном растении. Бактерия способна расти только в присутствии одного из опинов, используя его в качестве источника углерода и азота. Гены, ответственные за перенос Т-ДНК в растительную клетку и ее встраивание в хромосомную ДНК, находятся вне Т-ДНК. Т-ДНК обладает двумя свойствами, делающими ее идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений.

В качестве векторов привлекают внимание исследователей также ДНК хлоропластов и митохондрий. Плазмиды рекомбинированные с миникольцевыми молекулами ДНК хлоропластов и митохондрий, могут служить векторами, которые способны реплицироваться в клетках. Хлоропласты содержат до нескольких десятков кольцевых молекул ДНК одинакового размера, гомогенных по структуре. Хлоропластные ДНК способны к автономной репликации и транскрипции. При обработке их рестриктазами получают фрагменты ДНК, строго специфичные для каждого вида растений.

Митохондриальный геном растений устроен иначе. Если в хлоропластах ДНК представлена одинаковыми кольцевыми молекулами, то в митохондриях содержится несколько классов кольцевых молекул. Наличие миникольцевых ДНК характерно для митохондрий многих высших растений. Кроме того, митохондриальный геном растений отличается большой информационной емкостью. Не исключено, что роль универсального вектора смогут выполнять также мобильные генетические элементы, так называемые транспозоны.

Разработаны различные методы введения чужеродных генов в протопласты. Можно заражать протопласты, инкубируя их непосредственно с Ti-плазмидами, несущими нужный ген, в присутствии ПЭГ и Са²⁺. Т-ДНК проникают в протопласты и трансформируют их. После регенерации протопластами клеточной стенки и деления образованный каллус переносят на среду, не содержащую фитогормоны. В этих условиях выживают и размножаются клетки,

содержащие Т-ДНК, поскольку в этом сегменте есть гены, ответственные за синтез фитогормонов.

Можно заражать агробактериями культуру клеток. Через несколько часов бактерии убивают добавлением в среду антибиотиков и продолжают культивировать клетки до образования каллусов. Затем каллусы переносят на среду без гормонов, на которой выживают только трансформированные клетки. Эффективность метода культивирования протопластов с агробактериями составляет 10 %.

Кроме описанных выше естественных механизмов трансформации с использованием агробактерий, разработан ряд искусственных методов введения молекул ДНК в протопласты. Ее заключают в липосомы-пузырьки из фосфолипидов, которые к тому же могут надежно защищать ДНК от нуклеаз. Часть ДНК проникает в ядро и реплицируется там, что было установлено по поведению ДНК, меченой тритием. Эффективность метода 1 %.

Значительно более результативен метод микроинъекции ДНК (40 %). Этим методом можно вводить не только в протопласты, но и в клетки. Некоторые исследователи осуществляют прямую трансформацию под влиянием различных воздействий, например, электрического импульса либо ультрафиолетового лазера. В стенке клетки пробивается микроскопическое отверстие, которое через секунду заживляется, но за это время внутри клетки успевает проникнуть ДНК с эффективностью около 1 %.

Таким образом, возможность введения в клетки растений чужеродной генетической информации экспериментально доказана и открывает многообещающие перспективы для создания принципиально новых форм растений с хозяйственно ценными признаками.

Контрольные вопросы:

1. Из каких этапов складывается получение мутантных форм?

2. Цели и задачи клеточной инженерии.

3. Этапы при исследовании соматической гибридизации.

Дата добавления: 2014-01-04