Изолирование водой, подкисленной щавелевой кислотой

(метод Васильевой)

Идея изолирования подкисленной водой высказывалась разными исследователями. Так, еще в 1856 году С.Макадам предложил для подкисления воды использовать щавелевую кислоту, в 1861 г. Усляр и Эрдман -соляную, а в 1865 г. Г.Драгендорф - серную. Вплоть до 1941 г. водный метод не получал широкого распространения. В 1942-43 гг. Степановым А.В. и Швайковой М.Д. был предложен метод изолирования алкалоидов из объектов растительного происхождения водой, подкисленной щавелевой кислотой (ускоренный метод). В 1947-49 гг. этот метод был применен А.А.Васильевой к трупному материалу, после чего он вошел в практику судебно-химического анализа в отечественных лабораториях.

Схема изолирования по методу Васильевой заключается в следующем:

· Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной щавелевой кислотой до рН2-3, в течение двух часов. Вода берется в количестве 1:2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется.

· Экстрагирование веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера из водного фильтрата хлороформом при рН=2 (трехкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием (фракция А, «кислое» извлечение).

· Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя раствором аммиака до рН 9-10, экстрагирование веществ основного характера трехкратной экстракцией хлороформом, отделение органической фазы и концентрирование упариванием (фракция Б, «щелочное» извлечение).

pH 2, 2 часа

100 г органа

3 раза

CHCl₃

Изолирование «нелетучих» ядов из биологического материала водой, подкисленной щавелевой кислотой (метод Васильевой) проводится по следующей схеме:

		Выход 30-40%

По сравнению с изолированием подкисленным спиртом извлечение водой, подкисленной щавелевой кислотой, обладает рядом преимуществ:

1. Быстрота (анализ можно провести в течение одного рабочего дня).

2. Меньшее количеством операций, меньшие потери искомых веществ (алкалоиды извлекаются на 30-40%).

3. Экономичность и дешевизна, т.к. дорогой спирт заменен водой.

Недостатком метода является образование стойких эмульсий при экстрагировании веществ из водной фазы хлороформом, особенно при исследовании гнилостного биоматериала, т.к. метод не предусматривает очистки извлечений.

Частные методы изолирования:

- изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод американского ученого Валова)

- изолирование алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко)

- другие методы для отдельных групп веществ

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод Валова) схематично можно представить следующим образом:

· Настаивание измельченного объекта с водой, подщелоченной 20% раствором гидроксида натрия до рН 10 и более, в течение 30 минут.

· Очистка водного извлечения путем насыщения вольфраматом натрия в кислой среде (Н₂SO₄ до рН 2), фильтрование раствора.

· Экстрагирование эфиром, концентрирование эфирного извлечения упариванием.

Выход составляет 50% и даже до 90% в зависимости от вида барбитурата. Метод дает достаточно чистые извлечения, т.к. включает стадию очистки (осаждение белков вольфраматом натрия), что повышает качество последующего анализа.

Изолирование барбитуратов из биологического материала частным методом (метод Валова) проводится по следующей схеме:

	H2O + NaOH

pH 2, осаждение белков

100 г

pH≥10, 30 минут

органа

Выход 50% и >

Недостатком метода является соосаждение барбитуратов с белками при обработке вольфраматом натрия. В последней модификации метода Н₂SO₄ заменена NaHSO₄, что увеличивает выход искомых веществ.

Частный метод изолирования алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко)

Метод был разработан Львовской школой судебных химиков под руководством заведующего кафедрой аналитической и токсикологической химии Львовского медицинского института проф. В.Ф.Крамаренко. В 1956-62 гг. целый ряд работ химиков этой школы был посвящен влиянию рН среды, природы экстрагента и присутствия в водной фазе электролита на эффективность изолирования алкалоидов из биоматериала.

Схема метода состоит из следующих этапов:

· Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной 20% раствором серной кислоты до рН2-3, в течение двух часов. Вода берется в количестве 1:2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется. Операция повторяется двукратно.

· Очистка водного извлечения от белковых соединений путем насыщения его сульфатом аммония, настаивания в течение часа и фильтрования образовавшегося осадка.

· Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов путем экстракции эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают.

· Подщелачивание водного извлечения 20% раствором гидроксида натрия и экстрагирование веществ основного характера хлороформом при рН=9-10 (трехкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием.

Изолирование алкалоидов из биологического материала частным методом (метод Крамаренко) проводится по следующей схеме:

		Выход 50-70%

Разработанный вначале для алкалоидов, метод применим и для изолирования других N-содержащих веществ основного характера (синтетических лекарственных средств).

Метод достаточно быстрый. Преимуществом является хорошая очистка извлечений от соэкстрактивных веществ.

Кроме указанных выше методов изолирования, для отдельных алкалоидов, таких, как жидкие алкалоиды - анабазин, никотин, кониин - рекомендуется перегонка алкалоидов с водяным паром с последующим экстрагированием из дистиллята органическим растворителем. Для стрихнина и пахикарпина предложены такие методы, как электрофорез и электродиализ.

Исследование биологических жидкостей.

1. При исследовании биожидкостей, таких, как кровь, моча, плазма, слюна, сыворотка, промывные воды желудка, для изолирования «нелетучих» ядов используют прямую дробную жидкость - жидкостную экстракцию (ЖЖЭ).

Биожидкость подкисляют хлористоводородной кислотой до рН2-3 и экстрагируют эфиром (фракция А), а затем подщелачивыают до рН 9-10 и экстрагируют хлороформом (фракция Б). Во фракции А присутствуют вещества кислого и нейтрального характера, а во фракции Б - вещества основного характера.

ЖЖЭ соответствует второй стадии изолирования ядов из биоматериала в рассмотренных ранее общих методах, поэтому все факторы, определяющие эффективность изолирования на этой стадии, имеют здесь место.

Для некоторых веществ основного характера, например, для морфина, при изолировании его из мочи предварительно проводят кислотный гидролиз, чтобы разрушить его комплекс с глюкуроновой кислотой, в виде которого он находится в моче. При прямой ЖЖЭ совместно с ядами из биожидкостей могут экстрагироваться сопутствующие вещества, что заставляет в дальнейшем прибегать к различным методам очистки.

Изолирование биологических жидкостей (жидкость-жидкостная экстракция, ЖЖЭ) проводится по следующей схеме:

2. В последнее время для изолирования ядов из биожидкостей стали использовать сорбцию их на синтетических смолах, модифицированных силикагелях и активированном угле. Вещества сорбируются на твердом носителе, а потом вымываются (элюируются) из него органическим растворителем (по фракциям). Метод позволяет не проводить дополнительную обработку пробы и изолирование, дает возможность одновременно сконцентрировать вещество и провести очистку. Это приводит к повышению чувствительности метода. Однако, при неизвестном яде сорбция не всегда может быть использована ввиду опасности его потери из-за недостаточной сорбции и проскакивания через колонку сорбента.

ОЧИСТКА ИЗОЛИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ ОТ СОПУТСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ БИОМАТЕРИАЛА.

При изолировании ядовитых веществ из биоматериала совместно с ними экстрагируются так называемые соэкстрактивные вещества - примеси белков, продуктов их гидролиза - пептидов и аминокислот, липидов и ряда других соединений, которые являются естественными компонентами биоматериала.

Соэкстрактивные вещества в дальнейшем мешают проведению анализа:

1. Маскируют окраску при проведении реакций окрашивания (обугливание соэкстрактивных веществ под действием концентрированной серной кислоты).

2. Снижают чувствительность микрокристаллических реакций и приводят к образованию кристаллов неправильной формы, либо к их полиморфизму (многообразие форм).

3. Искажают спектры веществ при исследовании в УФ - и ИК-областях.

4. Дают завышенные результаты количественного определения веществ.

5. Многие продукты гнилостного разложения биоматериала дают такие же реакции, как и некоторые ядовитые вещества (например, трупные алкалоиды - путресцин, кадаверин – дают реакции с общеалкалоидными реактивами).

Для получения надежных результатов необходима очистка исследуемых веществ от соэкстрактивных компонентов биоматериала. Очистка может быть проведена при подготовке объекта, в процессе изолирования или после него.

На 1 этапе изолирования возможна только грубая очистка, которая проводится путем:

1 - удаления механических загрязнений (мелких частиц биоматериала) фильтрованием или центрифугированием.

2 - осаждения примесей при добавлении соответствующих реагентов, например, осаждение белков абсолютным спиртом, ацетоном, трихлоруксусной кислотой, вольфрамовой, фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой кислотами, насыщение электролитами (Nа₂SO₄, (NH₄)₂SO_4, NaCl). При этом возможно соосаждение искомых веществ, что ведет к частичной их потере.

3 - изменения состава фаз, т.е. введения другого органического растворителя (связано с большими потерями веществ)

На 2 этапе изолирования или после него возможна более тонкая очистка, которая осуществляется путем:

1 - реэкстракции, т.е. переведения веществ из одной жидкой фазы в другую при изменении рН раствора (например, очистка барбитуратов и алкалоидов за счет различной растворимости их солеобразных и молекулярных форм в воде и органических растворителях). При этом примеси отделяются от экстрагируемого вещества за счет нерастворимости в используемом экстрагенте. Либо, наоборот, экстрагирование примесей из раствора подходящим экстрагентом (эфир в методе Крамаренко В.Ф.)

2 - сублимации - для веществ, способных возгоняться без разложения при нагревании (салициловая кислота, бензойная кислота, барбитураты, жидкие алкалоиды).

3 - хроматографии - ионообменной, гель-хроматогрфии, адсорбционной хроматографии на колонках, тонкослойной хроматографии. Последний вид хроматографии используется значительно чаще, т.к. наряду с очисткой дает возможность разделить вещества при комбинированных отравлениях и провести их предварительную идентификацию по величинам R_f (хроматографический скрининг «нелетучих» ядов).

Дата добавления: 2014-01-04