План лекции. Форма проведения лекции:проблемная лекция

Суспензионные культуры

Лекция 8

Форма проведения лекции: проблемная лекция

1. Культивирование клеток в жидкой среде

2. Получение суспензионной культуры

1 Культуру клеток растений, выращиваемую в жидкой среде, называют суспензионной культурой. Для поддержания клеток во взвешенном состоянии при глубинном культивировании их перемешивают разными аппаратами. Аэрация клеток обеспечивается либо путем непрерывного вращения или качания среды, либо путем продувания жидкой среды стерильным воздухом. В отдельных экспериментах инкубируемые клетки не бывают погружены в питательную среду постоянно, а попеременно контактируют с жидкой средой и воздухом. В этом случае газообмен существенно улучшается. Состав питательной среды, в принципе, тот же, что и при поверхностном культивировании клеток.

Клетки в суспензии имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками, выращиваемыми статистическим способом на агаризованной поверхности: клетки популяции находятся в однородных условиях питания, аэрации и удаления токсических метаболитов клеточного окружения: у них легче проследить влияние на рост и метаболизм различных экзогенных факторов: они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических исследований: на них реальнее возможность получения стабильной клеточной популяции.

2 Обычно для получения суспензионной культуры клеток используется каллусная ткань. Возможно получение суспензионной культуры из эксплантов, помещенных в жидкую среду (например, пыльников). Возникающие на поверхности экспланта каллусные клетки могут отрываться и переходить в среду, давая начало суспензии. Но это длительный и малоэффективный процесс. Для некоторых исследований культуру клеток получают путем ферментативной мацерации, например, из мезофилла листа, но такую суспензию невозможно поддерживать в течение длительного времени.

Основным способом получения суспензионных культур является культивирование рыхлого недифференцированного каллуса в жидкой среде на качалке. При этом каллус легко распадается на отдельные клетки и клеточные агрегаты. Рыхлый оводненный каллус выращивают специально для этих целей на среде с 2,4 –Д с уменьшенным содержанием или даже с исключением цитокининов. Хороший эффект на дезагрегацию каллуса оказывает также исключение из питательной среды Са²⁺, поскольку вследствие этого меньше образуется пектината кальция – основного связывающего материала растительных клеток. Пектинат кальция можно удалить воздействуя на каллус пектиназой.

Часть каллусной ткани в жидкой среде при ее перемешивании распадается на клетки и небольшие клеточные агрегаты, образуя первичную суспензию. Для избавления от крупных плотных остатков каллуса, от больших клеточных агрегатов ее фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлон либо отбирают одиночные клетки и мелкие агрегаты путем осаждения крупных агрегатов при отстаивании суспензии в течение нескольких минут. Кроме того, долю одиночных клеток и мелких агрегатов увеличивают частые пересевы легких фракций суспензии. На степень диссоциации клеток оказывает влияние также состав питательной среды, способы аэрации и перемешивания суспензии. Несмотря на все усилия, суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50-60 %, остальное приходится на долю групп из 2-10 клеток и многоклеточ-ные агрегаты. В очень крупных агрегатах наружные и внутренние слои клеток оказываются в неравноценных условиях питания и аэрации.

С целью получения высокодиспергированной суспензионной культуры чаще всего пытаются контролировать состав питательной среды. Имеются сведения, что ауксины оказывают положительное влияние на процессы диссоциации клеток, а цитокинины, напротив, тормозят их. Следовательно, условия, благоприятствующие растяжению клеток и тормозящие их деление, способствуют максимальной диссоциации суспензионных клеток.

Природа угдеводов в питательной среде, оказывая влияние на межклеточные контакты через изменение поверхностных полисахаридов, также может играть определенную роль. Так, введение в питательную среду галактозы, раффинозы или сахарозы приводило к формированию очень больших клеточных агрегатов в суспензии клеток розы. Выращивание клеток с добавлением целлюлолитических ферментов (пектиназа, целлюлаза) в сочетании с осмотиком увеличивало дисперсию суспензии.

Как бы ни заманчива была перспектива получения в суспензии популяции, состоящей исключительно из отдельных клеток, с точки зрения биологии растительной клетки такая задача представляется малореальной. Для этого необходимо, чтобы после образования срединной пластинки дочерние клетки расходились до начала их следующего деления. Хорошей считается суспензия, состоящая из морфологически выравненных клеток, имеющих небольшие размеры и агрегированных в мелкие группы, включающие не более 10 клеток. Оптимальная плотность клеток в суспензии, обеспечивающая хороший рост, составляет 10⁵-10⁶ на 1 мл среды.

Суспензионные культуры пересевают чаще, чем каллусные, из которых они были получены. Инокулюм - это часть суспензионной культуры, используемая для пересадки на свежую питательную среду. Инокулюм отбирают стерильными пипетками, шприцами или просто переливают определенную часть суспензии. Последний способ является единственно приемлемым для культур, содержащих крупные агрегаты клеток.

Дата добавления: 2014-01-04