Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Инструменты генетической инженерии





Ферменты разрезания и сшивания нужных фрагментов ДНК. Для того, чтобы искусственным путем наделить организм новыми наследственными свойствами (создать трансгенную особь), нужно ввести в него хотя бы один чужеродный ген. Причем, необходимо приготовить (сконструировать) фрагмент чужеродной ДНК, содержащий этот нужный ген. Осуществляется эта процедура с помощью двух операций: "разрезания" и "сшивания". Роль портняжных инструментов играют ферменты рестриктазы и лигазы.

Рестриктазы (своеобразные молекулярные ножницы), действуя на двухцепочечную ДНК, "узнают" в ней определенную последовательность нуклеотидов. Причем, каждая рестриктаза узнает только свою последовательность ДНК, прикрепляется к ней и разрезает ее в месте прикрепления. Рестриктазам безразлично, какую ДНК разрезать – человека или растения, бактерии или вируса, лишь бы в ней были распознаваемые участки.

Обычно рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 – 6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются "липкими", поскольку они могут, как бы слипаться между собой в силу комплементарности.

Ярким примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ[VV247] , и режет эту последовательность ДНК ассиметрично, «ступенькой» между нуклеотидами Г и А (рис. ).

В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы притягиваются друг к другу, желая восстановить свои старые связи и скрепиться, как им и положено, водородными мостиками (см. Принцип комплементарности, § 6).

Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов (допустим слона и лягушки) то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу “липкие концы”. Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК.

Ниже в качестве примера приведены последовательности двух фрагментов ДНК, выделенных из организмов разных видов.

1)5`-АГЦАТАЦТГТГААТТЦАЦА-3`

3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТААГТГТ-5`

2)5`-АТГААТТЦТТАГЦАТАЦ-3`

3`-ТАЦТТААГААТЦГТАТГ-5`

 



Если мы хотим получить гибридную молекулу ДНК, то на первом этапе необходимо разрезать представленные фрагменты ДНК разных видов с помощью подходящих рестрикционнных ферментов. В данном случае можно использовать рестриктазу EcoRI, которая расщепит ДНК двух видов на четыре новых фрагмента 1а, 1б и 2а, 2б с липкими концами ААТТ и ТТАА:

1а) 5`-АГЦАТАЦТГТГ 1б) ААТТЦАЦА-3`

3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТАА ГТГТ-5`

 

2а)5`-АТГ 2б) ААТТЦТТАГЦАТАЦ-3`

3`-ТАЦТТАА ГААТЦГТАТГ-5`

В ходе второго этапа необходимо смешать нужные нам фрагменты разных видов, допустим, 1а и 2б. В результате выступающие липкие концы скрепятся между собой, как им и положено, водородными связями в силу комплементарности.

5`-АГЦАТАЦТГТГ А-А-Т-Т-ЦТТАГЦАТАЦ-3`

3`-ТЦГТАТГАЦАЦ-Т-Т-А-А ГААТЦГТАТГ-5`

 

Окончательное скрепление фрагментов 1а и 2б двух молекул ДНК производит фермент ДНК-лигаза, которая “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы обоих фрагментов между нуклеотидами Г и А с образованием полной структуры ДНК. Таким образом, получение межвидовой гибридной молекулы ДНК завершено.

Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах.

Векторы – устройства для доставки и клонирования чужеродных генов. С помощьюферментов рестриктаз и лигаз исследователи научились конструировать разнообразные по своим составным частям гибридные ДНК,путём сшивки различных фрагментов in vitro.

Но как полученным фрагментам ДНК, несущим ценные гены попасть в клетку и начать там “работать” – производить белки?

Для доставки чужеродных генов в различные организмы учёные стали применять специальные устройства, так называемые векторы. Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. В английской литературе вектор часто обозначается словом vehicle – повозка.

Идеальными векторными молекулами, созданными самой природой, оказались плазмиды, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие[VV248] в цитоплазме бактерий. Плазмиды способны к автономной репликации, обладают генами устойчивости к различным антибиотикам, что позволяет легко обнаружить их присутствие в клетках. Плазмиды могут внедряться в хромосому клетки хозяина, а также имеют участки ДНК (сайты рестрикции) для действия ряда рестриктаз. Первым успешным вектором, который начали использовать в генной инженерии, стала кольцевая плазмида pSC101. Она несет только один участок расщепления рестриктазой EcoR1 и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концыкоторой могут «слипаться» между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, полученными под действием той же рестриктазы. Этапы введения фрагмента чужеродной ДНК в простейший плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoR1 и последующее внедрение рекомбинантной плазмиды в бактерию Кишечная палочка (E. coli) для клонирования (размножения) нужного рекомбинантного гена схематически показаны на рис. .

По мере развития методов генной инженерии совершенствовались и плазмидные векторы. Широкое распространение получила плазмида pBR322а позднее другие классы плазмидных векторов несущие важный функциональный ген lac Z в котором расположен полилинкер, искусственно созданный участок множественного клонирования, содержащий более 10 сайтов рестрикции. [BЭ249]

Помимо плазмид в качестве векторов стали успешно использовать фаги и вирусы. Позже были созданы космиды – особый тип векторов, сочетающих свойства плазмиды и фага.

Таким образом, последовательно была создана основная триада элементов техники генной инженерии: выделение генов, «сшивание» их с вектором, доставка гибридной структуры (конструкции) в конкретный организм, где она сможет размножаться и наследоваться в потомстве.[BЭ250]

1.Что называют рестриктазами и какую функцию они выполняют? 2.Чем отличаются разрезанные фрагменты ДНК с липкими и тупыми концами? 3.Как называются ферменты, которые лигируют (сшивают) фрагменты ДНК с образованием полной двухцепочечной структуры? 4. Что такое векторы, какие типы векторов вам известны? 5. Какую из нижеприведенных последовательностей ДНК можно разрезать с помощью рестриктазы EcoRI?

а) 5`-АГЦГТАЦТГТГААТТЦАЦА-3` б) 5`-ААЦАЦАЦТГТГАТТТЦАГЦ-3`

3`-ТЦГЦАТГАЦАЦТТААГТГТ-5` 3`-ТТГТГТГАЦАЦТАААГТЦГ-5

 





Дата добавления: 2014-01-04; Просмотров: 4352; Нарушение авторских прав?


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



ПОИСК ПО САЙТУ:


Рекомендуемые страницы:

Читайте также:
studopedia.su - Студопедия (2013 - 2020) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление
Генерация страницы за: 0.002 сек.