Получение промышленно важных стероидов

Применение в медицине иммобилизованных ферментов

Иммобилизованные ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, тромболитические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокачественным ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы - в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов.

Особенно выгодны инкапсулированные ферменты типа искусственной клетки. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита, а содержимое заполнено ферментом аспарагиназой, переносятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и поэтому применяются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частности саркомы.

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных отраслях становится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности в корне меняет химическое производство, способствует созданию новых биотехнологических процессов и методов терапии, оказывает огромное влияние на образ жизни человека.

Использование абсолютной субстратной специфичности и стереоспецифичности биологических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганизмов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В результате были получены новые соединения с лучшими фармакологическими свойствами. Биотрансформация стероидов обычно заключается в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный прогресс микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования прогестерона.

Важнейший источник стероидных гормонов - культура клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) корневого происхождения продуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины).

Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованных клеток, использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений, а также с совершенствованием технологии очистки получаемых соединений. Среды для биотрансформации имеют достаточно сложный состав, а реакция требует строгого контроля за каждым ее параметром (рН, время и т.д.). Среда для осуществления реакции окисления кортизола в преднизолон культурой клеток Arthrobacter simplex включает пептон, глюкозу и кукурузный экстракт. Через сутки к смеси добавляют вещество S Рейхштейна.

Разработка крупномасштабного производства преднизолона путем биотрансформации стероидов позволила снизить стоимость этого препарата в 200 раз.

6 Получение инсулина, соматотропина и интерферонов

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин - небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника - препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид).

Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг. тремя коллективами исследователей в США, Китае и ФРГ.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. coli.

В 1981г. синтезирован ген – аналог проинсулина - мини-С-проинсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в E. coli.

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен вы 1963г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве.

Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм, из которых пять имеют 22 кДа, другие являются димерами, а остальные - фрагментами, образующимися при протеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий.

Сначала клонировали двунитевую рДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот.

Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида, обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. СТГ-РФ можно использовать и для увеличения массы и роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью, способен стимулировать освобождение гормона роста у ряда животных.

Получение интерферонов. Интерфероны были открыты в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирусной инфекции: он как бы препятствовал размножению вирусов в клетке и в силу этой способности был назван интерфероном.

Интерфероны широко используются для лечения различных тяжелых заболеваний - острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Их применяют и для лечения меланом, ряда опухолей гортани, легких и мозга.

С учетом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходим такие препараты, которые получены из клеток человека. Традиционно их извлекают из крови человека. С 1980г. одна из японских компаний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом сендай, после чего интерферон выделяли с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В Швеции лимфобласты выращивали в ферментерах объемом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.

Из всех видов интерферонов для мирового производства наиболее пригоден в- И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что дает возможность массового производства.

В целом вышеперечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1 Укажите правильную последовательность операций в технологической схеме получения убитой брюшнотифозной вакцины:

ферментация → отделение биомассы бактерий → выделение → инактивация → очистка от балластных веществ → адсорбирование продукта на Al(OH)₃ → стандартизация;

ферментация → инактивация → стандартное разведение → лиофильное высушивание → запаивание ампул;

получение гидролизата торфа → отдувка фурфурола и нейтрализация → культивирование дрожжей → отделение биомассы → экстракция продукта;

ферментация → декантация → сепарирование → центрифугирование → плазмолиз → сушка;

ферментция → сепарация → промывка → сепарация → промывка → плазмолиз → упаривание → сушка.

2 Выращивание бактерий→ отделение биомассы бактерий→ высушивание бактерий спиртом → экстрагирование →осаждение→ диализ и переосаждение спиртом→ гидролиз→ переосаждение спиртом→ лиофилизация – это стадии приготовления:

нитрагина;

энтобактерина;

брюшнотифозной вакцины;

ви-антигена;

нет верного ответа.

3 Какая существует наиболее эффективная мера борьбы с бактериофагами:

стерилизация при 120⁰ С не менее 20 минут;

пастеризация при 120⁰ С не менее 20 минут;

аммонификация при 120⁰ С не менее 20 минут;

денитрификация при 50⁰ С не менее 20 минут;

лиофилизация при 150⁰ С не менее 20 минут.

4 Положительная роль бактериофагов:

лизис бактерий в производстве;

использование в качестве векторов для клонирования;

увеличение выхода продукта;

уменьшение вязкости среды;

упрощение технологии.

5 Для лиофилизации колибактерий к суспензии бактерий и грибов добавляют

54% сахарозу;

молоко;

бульон;

10% сахарозу;

воду.

.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Биотехнология – принципы и применение / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. – М., 1988.

2 Быков В. А., Винаров Ю. Ю., Шерстобитников В. В. Расчет процессов микробиологических производств. – Киев, 1985.

3 Виестур У. Э., Шмите И. А., Жилевич А. В. Биотехнология – биологические агенты, технология, аппаратура. – Рига, 1987.

4 Воробева Л. И. Промышленная микробиология. – М., 1989.

5 Лиепиныш Г. К., Дунце М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. – Рига, 1986.

6 Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. – М., 1978.

7 Мосичев М. С., Складнев А. А., Котов В. Б. Общая технология микробиологических производств. – М., 1982.

8 Деймен А., Соломон Н. Промышленная микробиология. – М.,1984.

9 Виестур У. Э., Кузнецов А. М., Савенков В. В. Системы ферментации. – Рига, 1986

10 Биотехнология. /Под ред. А. А. Баева. – М., 1984.

11 Егорова Т. А. Основы биотехнологии. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 208 с.

12 Муромцев Г. С. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. – М.: Агропром, 1990. – 435 с.

13 Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. В. С. Шевелухи. – М.: Агропром, 1998. – 429 с.

14 Биотехнология / Т. Г. Волова – Новосибирск: Издательство СоРАН, 1999. – 252 с.

15 Солдатова А. В., Шумова Т. А. Культура клеток насекомых и ее использование для получения вирусных и энтомопатогенных препаратов. – М., 1983.

Лекция 9. Препараты для пищевой промышленности: хлебопекарные дрожжи, закваски, пищевой микробный белок.

Форма проведения лекции: бинарная

Дата добавления: 2014-01-04