Методы определения изоэлектрической точки белков

Изоэлектрическая точка- одна из важнейших характеристик белка. Все существующие методы её определения основаны на измерении свойств белков, связанных или с конформацией макромолекулы, или с их зарядом, при различных значениях рН. Во всех случаях готовится серия буферных растворов с различными значениями рН, в которые помещаются одинаковые количества исследуемого белка в виде раствора или в сухом виде.

Электрофоретический метод. Так как само выражение "изоэлектрическое состояние" говорит о равенстве числа положительных и отрицательных зарядов в амфиионах, ИЭТ можно определить с помощью электрофореза на бумаге, который проводится так. В прибор для электрофореза на бумаге вставляется несколько полосок фильтровальной или специальной хроматографической бумаги и каждая из них смачивается буферным раствором с определённым значением рН. На заранее отмеченное карандашом место в середине полосок пипеткой наносится капля раствора исследуемого белка. После этого прибор включается и через полоски бумаги с растворами проходит постоянный электрический ток.

В зависимости от рН буферного раствора макромолекулы изменяют свой заряд. В средах с рН > ИЭТ они заряжаются отрицательно:

NH₃⁺ NH₂ R + OH^- «R COO^- COO^-,

а в средах с рН < ИЭТ – положительно:

NH₃⁺ NH₃⁺ R + H⁺ «R COO^- COOH.

В растворе с рН, равным ИЭТ, макромолекулы белка приобретут нейтральный заряд. Таким образом, в электрическом поле макроионы будут перемещаться в различных направлениях, а нейтральные цвиттер-ионы останутся на месте в соответствии со схемой:

рН < ИЭТ	рН = ИЭТ	рН > ИЭТ
перемещение к катоду	смещение отсутствует	перемещение к аноду

Через какое-то время ток выключают, полоски бумаги высушивают и проявляют пятна белка, опрыскивая их раствором нингидрина. рН буферного раствора той полоски, на которой пятно белка осталось в том же месте, куда была нанесена капля, соответствует изоэлектрической точке белка.

Метод электрофореза может быть использован и для тонкого фракционирования белков. Так, например, можно разделить a-, b- и g-глобулины плазмы крови. поскольку каждый из них обладает своим значением ИЭТ, то степень их заряда в одном и том же буферном растворе будет различна. Поэтому каждая из этих фракций белков будет обладать своей скоростью движения в электрическом поле, что через определённое время приведёт к их разделению. Пятна каждой фракции, проявленные, например, с помощью люминесценции, вырезаются из полоски бумаги, вымываются соответствующим растворителем и при необходимости высушиваются.

В изоэлектрическом состоянии макромолекулы из-за минимального заряда обычно свернуты в клубки и наименее гидратированы. Это лежит в основе других методов, из которых наиболее надёжным и простым в исполнении является метод определения ИЭТ по минимуму вязкости. В этом случае с помощью вискозиметра измеряется относительная вязкость серии буферных растворов с добавлением одинакового количества белка. Из-за свёрнутости макромолекул белка, находящегося в изоэлектрическом состоянии, в наиболее плотные глобулы, наименьшей вязкостью будет обладать раствор с рН = ИЭТ.

Метод, связанный с действием водоотнимающих средств. Макромолекулы белков в изоэлектрическом состоянии наименее всего гидратированы. Поэтому выделение белков из раствора под действием водоотнимающих средств (например, спирт, ацетон в чистом виде или в присутствии нейтральных солей) происходит быстрее и полнее всего при рН, соответствующем изоэлектрической точке.

В принципе изоточка может быть определена и другими способами – по скорости застудневания, по степени набухания сухого белка и т. д. Однако эти методы не очень точны и требуют намного большего количества белка для исследования, что не всегда доступно.

Дата добавления: 2014-01-04