Дополнительный материал к занятию. Реакции иммунитета (окончание)

План изучения темы.

Исходный уровень знаний.

Реакции иммунитета (окончание).

Занятие 11

Цель самоподготовки.

После самостоятельного изучения материала необходимо знать о каждой из реакций:

- ингредиенты;

- механизм реакции;

- методы и схемы постановки;

- практическое применение;

- диагностические препараты.

Для усвоения материала необходимо повторить материал предыдущих занятий: комплемент и пути его активации; антигены и антитела; механизмы реакций иммунитета.

Цель занятия.

1. Изучить механизм и методы постановки реакций:

- иммунного бактериолиза и иммунного гемолиза;

- реакции связывания комплемента (РСК);

- реакции иммунофлюоресценции (РИФ);

- реакций иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинга;

- реакции иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

2. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований.

1. Реакции иммунного бактериолиза и гемолиза

2. Реакция связывания комплемента

3. Реакции с использованием меченых антигенов и антител: реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ, иммуноэлектронная микроскопия.

После изучения темы студент должен уметь.

Учесть и интерпретировать результаты следующих реакций:

- РСК;

- РИФ;

- ИФА;

- иммуноблоттинга;

- иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела), соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента расщепляется и среда окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н₂О₂ в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента расщепляется и среда приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченый радиоизотопом, напримерI¹²⁵. В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счетчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.

Контрольные вопросы.

Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки, контроли, практическое применение. Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Для чего необходимо определение титра и рабочей дозы комплемента? Что произойдет, если в реакции будет избыток комплемента или недостаточное количество его? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента? Каким способом обрабатывают комплемент для получения препарата с длительным сроком хранения? При постановке каких реакций иммунитета (из перечисленных) необходимо добавлять комплемент: реакция нейтрализации токсина антитоксином, реакция преципитации, реакция агглютинации, реакция иммунного бактериолиза, реакция иммунного гемолиза, РСК. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ): принцип реакции; укажите последовательность процессов при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты; что является антигеном, что - антителами, чем помечены антитела; как учитывается результат реакции, с помощью какого микроскопа; как выглядит положительный результат; практическое применение - что можно обнаружить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции - укажите последовательность событий при этой реакции; преимущество по сравнению с прямой РИФ. Иммуноферментный анализ (ИФА) - принцип реакции; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; то же - при обнаружении антител. Иммуноблоттинг - принцип реакции, основные этапы; как учитывается результат; преимущества реакции по сравнению с ИФА. Радиоиммунный анализ (РИА) - основные этапы реакции, какие сыворотки применяются, чем они помечены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия - принцип метода; основные этапы; какая сыворотка применяется, чем она помечена; как учитывается результат реакции?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Продолжение таблицы «Реакции иммунитета».

Работа студента на практическом занятии.

1. Учтите готовый результат РСК, заполните таблицу в рабочей тетради и сделайте вывод. Разберите диагностические препараты, необходимые для РСК.

2. Реакция иммунофлюоресценции. Составьте в тетради схему постановки РИФ. Посмотрите диагностические препараты; определите - что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите результат РИФ в люминесцентном микроскопе.

3. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции. Ознакомьтесь с системой для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего применяется.

4. Иммуноблоттинг. Разберите схему постановки реакции; посмотрите демонстрационный результат реакции.

5. Радиоиммунный анализ (РИА) - разберите схему постановки и учёта реакции.

6. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию - результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.

Дата добавления: 2014-01-04