Библиографический список

В пивоваренном производстве в засевных производственных дрожжах очень часто встречаются пивные сарцины (род Pediococcus). Сферические клетки (кокки) в парах, чаще в тетрадах или пакетах. Бесспоровые, грамположительны. Факультативные анаэробы. Каталазоотрицательные. Мезофилы. Оптимальное значение рН 4,5-5,0. Могут развиваться при содержании спирта до 8%. Лучше всего растут в присутствии дрожжей. Пивные сарцины вызывают сильное помутнение пива, сначала опалисцирующее, а затем с появлением мелкозернистого осадка. Иногда происходит увеличение вязкости пива и даже его ослизнение. Вследствие образования диацетила эти бактерии придают пиву характерный прогорклый маслянистый вкус и медовый аромат. Диацетил также отрицательно влияет на рост и размножение производственных дрожжей, ускоряет их оседание и отмирание. Развитие педиококков стимулирует образование продуктов распада белков, а также тиамина и рибофлавина, синтезируемых дрожжами.

Дикие дрожжи инфицирующие производственные дрожжи принято подразделять на две группы:

· Дикие дрожжи, принадлежащие к роду Saccharomyces;

· Дикие дрожжи, не принадлежащие к роду Saccharomyces.

При попадании в сусло на стадии брожения дикие дрожжи не могут интенсивно развиваться, так как их рост подавляется культурными дрожжами, количество которых по сравнению с содержанием инфицирующих пиво диких дрожжей значительно больше.

Дикие дрожжи, принадлежащие к роду Saccharomyces

В чаще всего встречаются следующие разновидности диких дрожжей-сахаромицетов: S. diastaticus, S. pastorianum, S. bayanus, S. ellipsoideus. В настоящее время все эти дрожжи принято относить к одному виду Saccharomyces cerevisiae, так как с точки зрения систематики различия в их признаках не являются существенными для разграничения видов. Клетки этих дрожжей имеют овальную или эллиптическую форму. Размножаются в основном почкованием, но могут и спорообразованием. Факультативные анаэробы. Активно сбраживают сахара. Оптимальная температура развития 27-35 ⁰С, рН – от 3,5 до 5,0.

Дикие дрожжи, не относящиеся к роду Saccharomyces

Из производственных дрожжей выделены следующие дрожжи этой группы: дрожжи родов Candida, Torulopsis, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Rhodotorula и др.

Дрожжи рода Candida имеют круглые, овальные или яйцевидные, а иногда удлиненные или неправильные формы клеток. Морфология клеток непостоянна и существенно меняется в зависимости от условий культивирования и питательной среды. Спор не образуют. На жидких средах развиваются преимущественно на поверхности в виде белой или сероватой пленки. Некоторые виды являются факультативными анаэробами, а другие – аэробами. Размножению большинства видов способствует присутствие в среде кислорода. Некоторые дрожжи этого вида продуцируют специфический белок, губительно воздействующий на культурные дрожжи (дрожжи-убийцы).

Дрожжи родов Pichia и Hansenula имеют клетки различной формы – от круглых и овальных до сильно вытянутых, иногда изогнутых. Многие виды образуют псевдомицелий. Образуют споры. Большинство видов – аэробы, некоторые виды относятся к факультативным анаэробам. Размножению способствует присутствие кислорода.

Дрожжи рода Rhodotorula обычно круглой, овальной, яйцевидной или удлиненной формы Спор не образуют.

Дрожжи рода Torulopsis (пивная торула) имеют круглую или овальную форму. Спор не образуют, плохо сбраживают сахара. Основным источником попадания этих микроорганизмов в производство является воздух.

Дрожжи рода Brettanomyces имеют клетки эллиптические, а также цилиндрические, удлиненно-продолговатые, нередко стрелозаостренные с одного конца. Образуют псевдомицелий. Спор не образуют. Являются факультативными анаэробами. Плохо сбраживают сахара. На жидких средах образуют хлопьевидный или вязкий осадок, могут образовывать тонкую пленку. Многие виды устойчивы к высоким концентрациям спирта.

Помимо вышеперечисленных групп микроорганизмов, инфицирующих производственные дрожжи, в них могут присутствовать гнилостные бактерии. Это спорообразующие грамположительные бациллы и клостридии и грамотрицательные не образующие спор палочковидные бактерии. Гнилостные бактерии вызывают распад белковых веществ. В аэробных условиях они осуществляют полную минерализацию белка, вплоть до диоксида углерода, аммиака, сероводорода, воды и минеральных солей. В анаэробных условиях гнилостные бактерии образуют различные органические дурнопахнущие и ядовитые вещества. Особую опасность представляют маслянокислые бактерии (Clostridium butyricum, Clostridium pasterianum, Clostridium saccharobutyricum и др.) и нитритобразующие бактерии (например, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus). Маслянокислые бактерии образуют масляную кислоту, а нитритобразующие бактерии превращают нитраты в нитриты. Эти соединения даже в очень малых концентрациях (0,0005 %) подавляют развитие культурных дрожжей.

Биологическая чистота является одним из самых важных показателей качества производственных дрожжей. Особое значение этот показатель имеет в пивоваренном производстве. Это связано с тем, что в пивоварении засевные производственные дрожжи используются в нескольких производственных циклах (до 10..12 генераций) и поэтому являются основным источником попадания в производство микроорганизмов-вредителей, вызывающих прокисание, помутнение, образование осадка в пиве и придающих продукту неприятные вкус и аромат. Биологическая чистота пивных дрожжей считается удовлетворительной, если в них содержится не более 1 % бактерий и не более 0,5 % диких дрожжей.

8.1.3 Микробиологический контроль качества производственных дрожжей

В пивоваренном производстве при контроле засевных дрожжей основным методом исследования является их микроскопирование. При микроскопировании дрожжевой суспензии определяют морфологическое состояние дрожжей, способность дрожжей к размножению, процентное содержание мертвых клеток, наличие посторонних микроорганизмов, содержание в дрожжах запасных питательных веществ (гликогена и волютина). В дрожжах хорошего качества морфологическое состояние должно быть удовлетворительным. Процентное содержание почкующихся клеток - высокое (40…70%), дрожжей, содержащих гликоген должно быть не менее 70…75%; биологическая чистота - удовлетворительная (не более 1% бактерий и 0,5% диких дрожжей), количество мертвых клеток – не более 5%. В дрожжах чистой культуры должны отсутствовать посторонние микроорганизмы и мертвые дрожжевые клетки. В засевных производственных дрожжах целесообразно также определять концентрацию дрожжевых клеток. Это исследование проводят с использованием счетной камеры Горяева.

Определение биологической чистоты дрожжей ведут также путем высева разведение из дрожжевой суспензии плотные питательные среды. Количество инфицирующих бактерий в засевных дрожжах определяется с использованием сусло-агара или дрожжевого агара с 1% глюкозы с мелом и антибиотиками (нистатином или актидионом). Для обнаружения диких дрожжей рода Saccharomyces исследуемые пробы прогревают при 50 ⁰С в течение 20 мин, а затем высевают на агар с ацетатом. В качестве элективных сред для этих дрожжей можно также использовать агар с кристаллвиолетом, сусло с 2% винной кислоты или 10% раствор глюкозы с 4% винной кислоты. Дрожжи, не относящиеся в роду Saccharomyces, определяют на синтетической среде с лизином. Рецептуры этих сред приведены в приложении 2.

В производстве спирта засевные производственные дрожжи регулярно просматривают под микроскопом, что дает возможность следить за их размножением, морфологическим и физиологическим состоянием, а также степенью загрязнения посторонними микроорганизмами. В засевных дрожжах количество почкующихся клеток должно быть не более 3%. Так как производственные дрожжи готовятся в не стерильных условиях, в них может присутствовать некоторое количество бактерий. О инфицировании засевных дрожжей кислотообразующими бактериями (молочнокислыми, уксуснокислыми) свидетельствует повышение титруемой кислотности более чем на 0,05 град. В сильно инфицированных дрожжах могут быть подвижные спорообразующие бактерии, распознавание которых осуществляют путем окраски раствором йода (маслянокислые бактерии при этом окрашиваются в серо-голубой цвет). Обращают также внимание на наличие диких дрожжей, количество мертвых клеток (не более 5%). Учитывают также упитанность дрожжей по гликогену - в нормальных дрожжах гликоген занимает от 1/3 до 2/3 объема клетки. Если гликогена меньше 1/4 объема клетки, его содержание считается недостаточным.

Путем микроскопирования определяют также процентное содержание мертвых и почкующихся клеток и концентрацию дрожжевых клеток в бражке. Значения этих показателей в процессе брожения меняется. Так, в первые часы брожения концентрация дрожжевых клеток в бражке составляет 100 – 150 млн./см³, почкующихся клеток – 10…12%, мертвых – до 3…4%. В дальнейшем концентрация дрожжевых клеток и процентное содержание мертвых клеток увеличивается, а относительное содержание почкующихся клеток уменьшается.

Для установления степень инфицирования бражки посторонними микроорганизмами ее исследуют под микроскопом не реже 3 раз в сутки (из каждого бродильного аппарата). В первые часы брожения посторонние микроорганизмы должны отсутствовать, в период главного брожения допускается наличие единичных клеток, а при дображивании – 3…5 клеток посторонних микроорганизмов в поле зрения микроскопа.

Микробиологический контроль хлебопекарных прессованных дрожжей включает:

· Микроскопирование. При микроскопировании оценивают качество прессованных дрожжей – по величине, по однородности клеток и по наличию посторонних микроорганизмов (бактерий, диких дрожжей), процентному содержанию мертвых клеток.

· Определение процентного содержания сахаромицетов и посторонних микроорганизмов с использованием плотных питательных сред проводят в случае резкого ухудшенияподъемной силы и при снижении стойкости прессованных дрожжей. Упрощенный метод – посев на сусло-агар с мелом (подсчитывают общее количество выросших на среде колоний и отдельно - колонии кислотообразующих бактерий, вокруг которых имеются зоны растворения мела). Усложненный метод – посев на несколько элективных питательных сред для выявления количества клеток посторонних микроорганизмов и распределения их по группам. В качестве элективных сред используют сусло-агар (8 % СВ) – для определения общего количества дрожжей и грибов; сусло-агар (12 % СВ) с мелом и нистатином (для определения молочнокислых бактерий); среда 10 на дрожжевой воде (для определения слизеобразующих бактерий – лейконостоков); молочный агар с нистатином (для определения гнилостных бактерий); дрожжевой агар с 4 % сахарозы и нистатином (для определения общего количества бактерий); синтетическая среда с лизином (для определения несовершенных дрожжей) и др. Состав этих сред и особенности их приготовления приведены в приложении 2. Общее количество дрожжей принимают за 100 % и определяют процентное содержание посторонних видов дрожжей, грибов и бактерий. В доброкачественных прессованных дрожжах допускается присутствие кислотообразующих бактерий не более 15…35 %, гнилостных дрожжей быть не должно, посторонних (диких) дрожжей – не более 30 %.

8.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

На занятии студенты знакомятся с морфологическими, физиологическими и призводственно-ценными свойствами культурных дрожжей и изучают свойства посторонних микроорганизмов, инфицирующих производственные дрожжи. Знакомятся с методами оценки качества производственных дрожжей. Путем микроскопирования определяют основные показатели качества дрожжей. Определяют концентрацию дрожжевых клеток методом прямого счета с использованием счетной камеры Горяева.

8.2.1 Определение биологической чистоты дрожжей

Готовят фиксированных мазок из густой дрожжевой суспензии. Окрашивают его по Гаму (разд.3.2.1) или простым методом (разд. 2.2.3). Далее препарат микроскопируют в иммерсионной системе с использованием объектива х90. Рассматривают препарат в 10 полях зрения. При микроскопировании обращают внимание на наличие посторонних бактерий и диких дрожжей (морфологические свойства бактерий и диких дрожжей, инфицирующих производственные дрожжи описаны в разд. 8.1.2).

Определение биологической чистоты можно также вести путем приготовления препарата «раздавленная капля» с использованием фазово-контрастного микроскопа. В этом случае на предметное стекло наносят каплю дрожжевой суспензии и добавляют каплю 10% раствора КОН или 50% уксусной кислоты для растворения белков и жировых частиц, что облегчает просмотр препарата. Далее накрывают препарат покровным стеклом и микроскопируют с объективом х40 и рассматривают в 20 полях зрения В поле зрения должно быть около 50 клеток дрожжей.

8.2.2 Определение морфологического состояния дрожжей

Ведут путем микроскопирования препарата «раздавленная капля» в затемненном поле зрения микроскопа с объективом х40. Для этого на предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и накрывают ее покровным стеклом. Излишки воды удаляют фильтровальной бумагой.

При микроскопировании обращают внимание на форму, размеры клеток, толщину оболочек, структуру цитоплазмы, наличие почкующихся клеток.

Дрожжи должны иметь форму и размеры, соответствующие применяемой расе. Клетки должны быть равномерной величины, с тонкой оболочкой, однородной или мелкозернистой цитоплазмой, небольшими вакуолями. Количество почкующихся клеток в засевных дрожжах, используемых в пивоварении должно составлять 40…70%. Наличие большого количества морфологически измененных клеток свидетельствует о дегенерации культуры, поэтому такие дрожжи использовать в производстве не рекомендуется. Зернистая цитоплазма, крупные вакуоли и отсутствие почкующихся клеток характеризует старую культуру.

8.2.3 Определение процентного содержания мертвых клеток

На предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и каплю раствора синьки Финка (раствор метиленового синего концентрацией 1:5000). Через 2 мин препарат накрывают покровным стеклом, излишки воды убирают с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопирование ведут в 5 полях зрения. При этом подсчитывают количество всех дрожжевых клеток, а также отдельно считают количества мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток. Далее рассчитывают процентное содержание мертвых клеток.

Определение мертвых клеток в дрожжевой суспензии можно проводить и с помощью водного раствора красителя нейтрального красного в концентрации 1:10000. При этом мертвые клетки окрашиваются в красный цвет, а в живых клетках окрашиваются только включения цитоплазмы. При окрашивании дрожжевой суспензии раствором нейтрального красного микроскопирование ведут через 15 мин после окраски.

8.2.4 Определение запасных веществ (гликогена, волютина)

в клетках дрожжей

Основными запасными веществами дрожжевой клетки являются гликоген и волютин (зерна метахроматина).

Гликоген – запасной полисахарид дрожжевой клетки. По содержанию гликогена судят об упитанности дрожжей. Если гликогена в дрожжах мало, то это свидетельствует о том, что они длительное время находились без питательного субстрата и имеют поэтому низкую бродильную активность.

Волютин – запасной полифосфат в соединении с простыми белками и рибонуклеиновой кислотой. В состоянии активного обмена волютин в клетках дрожжей располагается мелкими каплями по стенкам вакуолей или непосредственно под клеточной стенкой. В больших количествах волютин накапливается перед почкованием. Накопление волютина особенно интенсивно происходит при выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами.

8.2.4.1 Определение гликогена

Для определения гликогена на предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и каплю 0,5% раствора йода. Через 2…3 мин цитоплазма клеток окрашивается в светло-желтый цвет, а гранулы гликогена – в красно-бурый. Препарат накрывают покровным стеклом и удаляют излишек жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с объективом х40.

8.2.4.2 Определение волютина методом Омелянского

1. Готовят фиксированный мазок из густой дрожжевой суспензии;

2. Препарат в течение 30…60 сек окрашивают раствором фуксина Циля;

3. Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой;

4. Мазок обрабатывают 1%-ным раствором H₂SO₄ в течение 20…30 сек, при этом клетки обесцвечиваются, а волютин, так как он устойчив к действию кислот, сохраняет окраску;

5. Препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой;

6. Дополнительно докрашивают мазок метиленовым синим (1:40) в течение 15…30 сек, промывают его водой и подсушивают фильтровальной бумагой;

7. Препарат микроскопируют в иммерсионной системе с объективом х90.

Микроскопическая картина: гранулы волютина красного цвета, клетки – синего.

8.2.5 Определение концентрации дрожжевых клеток с помощью

счетной камеры Горяева

Для подсчета клеток в дрожжевой суспензии используют счетные камеры Горяева, Тома-Цейса, Бюркера и др.

Счетная камера Горяева (рис. 15) представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечно расположенные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. На каждой половинке выгравирована микроскопическая сетка. Сетка разделена на большие и малые квадраты: площадь большого квадрата равна 1/25 мм², малого – 1/400 мм². Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла.

а h ÈÈ б

в

Рис. 15 Счетная камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку;

в – деление камеры на квадраты; h – глубина камеры

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. После этого заполняют камеру исследуемой дрожжевой суспензией. Суспензию вносят через бороздки камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток производят через 3…5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости.

Камеру помещают на предметный столик и рассматривают в затемненном поле зрения с объективами вначале на х8, а затем на х40. Клетки подсчитывают в 10 больших или в 20 маленьких квадратах, перемещая их по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки и на пограничных линиях, если они больше, чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух их четырех сторон квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20…30, а в малом - 10, в противном случае делают разведение.

Количество клеток в 1 см³ исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

M = a × n × 10³ S ×h,

где М – число клеток в 1 см³ дрожжевой суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

n – разведение дрожжевой суспензии (если оно применялось);

S – площадь квадрата сетки, мм²;

h – глубина камеры.

Пример: При подсчете взвеси дрожжей в камере Горяева обнаружено 20 дрожжевых клеток в одном большом квадрате. Густая взвесь предварительно была разведена 1:100. Следовательно, М = 20 × 1000 × 25 × 100 0,1= 5,0 × 10⁸ кл/см³.

Оформление и анализ результатов исследований

Студенты конспектируют теоретический материал и методы микроскопического исследования производственных дрожжей. Определяют биологическую чистоту дрожжей, их морфологическое состояние, концентрацию мертвых и почкующихся клеток, наличие гликогена и волютина. Подсчитывают концентрацию дрожжевых клеток с помощью камеры Горяева. Микроскопическую картину, отражающую морфологическое состояние дрожжей зарисовывают. Делают вывод о качестве исследованных дрожжей используя данные, представленные в разделе 8.1.3.

Контрольные вопросы

1. Охарактеризуйте морфологические и физиологические свойства дрожжей – сахаромицетов.

2. В чем отличие дрожжей верхового брожения от дрожжей низового брожения?

3. В каких производствах используются дрожжи верхового брожения, а в каких – низового брожения?

4. Какие дрожжи используются в производстве пшеничного и ржаного теста? Перечислите требования, предъявляемые к хлебопекарным дрожжам.

5. Какими производственно-ценными свойствами должны обладать пивные дрожжи?

6. Дрожжи какого вида используются в производстве спирта? Каким требованиям должны удовлетворять спиртовые дрожжи?

7. Какие микроорганизмы чаще всего инфицируют производственные дрожжи? Каким образом можно определить посторонние микроорганизмы в производственных дрожжах?

8. Какие микробиологические показатели определяются при контроле качества засевных производственных дрожжей в пивоваренном производстве, в производстве спирта? Как осуществляют микробиологический контроль хлебопекарных дрожжей?

9. Как определить концентрацию клеток в дрожжевой суспензии?

10. Как и для чего определяется гликоген в клетках дрожжей?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №9

САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСЛОВИЙ

ПРОИЗВОДСТВА

(выполняется на двух занятиях)

Цель работы: Ознакомиться с организацией санитарно-гигиенического контроля на предприятиях пищевой промышленности. Освоить микробиологические методы, позволяющие оценить санитарное состояние воды, воздуха производственных помещений, оборудования, тары, упаковочных и вспомогательных материалов, рук и спецодежды работников.

Оборудование, материалы: термостаты, микроскопы, спиртовки, плитки, пробирки с тампонами для приготовления смывов, пробирки со средой Кесслера, средой Кода, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см³, стерильные колбы на 500 см³, питательные среды: мясопептонный агар, сусло-агар или среда Сабуро, бактериологические петли, предметные стекла, набор красок по Граму, фильтровальная бумага.

9.1.КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

9.1.1Организация санитарно-гигиенического контроля

на предприятиях пищевой промышленности

Санитарно-гигиенический контроль условий производства на предприятиях пищевой промышленности осуществляется общегосударственной и ведомственными службами.

Государственный санитарный надзор осуществляется санитарно-зпидемиологической службой (СЭС) в форме предупредительного (при проектировании и строительстве) и текущего надзора за выполнением установленных для предприятий молочной промышленности санитарно-гигиенических требований. Текущий контроль может быть плановый и внеплановый.

Органы и учреждения государственного санитарного надзора наделены широкими полномочиями. Распоряжения и указания представителей санитарной службы являются обязательными для администрации предприятия. Их невыполнение несет за собой административную ответственность руководителей предприятий, цехов и отделов, отдельных работников.

Принудительные административные меры применяются и при выявлении нарушений, представляющих непосредственную угрозу для здоровья людей. В таких случаях может быть установлен запрет на дальнейшую эксплуатацию предприятия (например, запрет на выпуск продукции).

При особо серьезных нарушениях, повлекших или могущих повлечь за собой возникновение пищевых заболеваний или другие вредные последствия, органы санитарного надзора могут привлекать виновных к уголовной ответственности.

Внутриведомственный санитарный контроль осуществляют ведомственная санитарная служба и заводская лаборатория. Они контролируют выполнение требований СанПиНа для предприятий пищевой промышленности, регулярно следят за санитарным состоянием производства, за профилактическими обследованиями работников цехов и соблюдением ими правил личной гигиены. Результаты проведения санитарно-гигиенического контроля фиксируются в специальном журнале.

При отборе проб для микробиологических исследований представителями санитарно-эпидемиологической службы, микробиологи предприятия также проводят отбор проб и их исследование. В случаях систематических расхождений результатов, получаемых службой СЭС и ведомственными лабораториями, проводят по согласованию совместные исследования для уточнения методов анализа и интерпретации их результатов.

9.1.2 Оценка санитарного состояния воздуха производственных помещений

Воздух производственных помещений может стать источником микробного загрязнения молочных продуктов.

Санитарно-гигиеническая оценка воздуха производственных помещений проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и содержанию санитарно-показательных микроорганизмов – гемолитических стрептококков и стафилококков. Воздух производственных помещений считается чистым, если КМАФАнМ не превышает 1500 КОЕ/м³, а гемолитических стрептококков и стафилококков не более 16 в 1 м³. В качестве питательных сред используют мясопептонный агар (для определения КМАФАнМ) и кровяной агар (для определения гемолитических стрептококков и стафилококков).

Для определения микроорганизмов в воздухе используют седиментационный и аспирационный методы.

Седиментационный метод основан на самопроизвольном оседании пылинок и капель вместе с микроорганизмами на поверхность плотной питательной среды в открытых чашках Петри.

Аспирационный метод заключается в принудительном оседании микроорганизмов из воздуха на поверхности плотных питательных сред. Осуществляется аспирационный метод с помощью специальных приборов (например, прибора Кротова), снабженных вентиляторами, которые засасывают воздух в прибор через клиновидную щель. В приборе воздух ударяется о поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри.

Помимо нормируемых микробиологических показателей в воздухе производственных цехов и холодильниках на предприятиях пищевой промышленности определяют наличие спор микроскопических грибов и дрожжей, произвольно оседающих на поверхности сусло-агара или среды Сабуро за 5 минут. Посевы культивируют при комнатной температуре в течение 5-и суток. Санитарно-гигиеническая оценка проводится по 3-х бальной шкале. Состояние воздуха отличное, если в посевах споры грибов и дрожжей не обнаружены; хорошее, если на поверхности среды оседает до 2 спор грибов, а споры дрожжей не выявлены; удовлетворительное, если в чашках Петри после культивирования вырастает не более 5-и колоний грибов и 2-х колоний дрожжей.

Для снижения бактериальной обсемененности воздуха на предприятиях молочной промышленности проводят проветривание и влажную уборку помещений. Снизить содержание микроорганизмов в воздухе можно также путем его фильтрации через воздушные фильтры, применяя физические и химические методы обеззараживания воздуха: обработку ультрафиолетовыми лучами, хлорсодержащими препаратами в виде испарений и аэрозолей. Эффективным способом является озонирование воздуха.

9.1.3 Оценка санитарного состояния воды

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям СанПиНа 2.1.4.1074-01 на питьевую воду.

Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число – не более 50 КОЕ/см³; термотолерантные колиформные бактерии – не допускаются в 100 см³; общие колиформные бактерии также должны отсутствовать в 100 см³; споры сульфитредуцирующих клостридий - не допускаются в 20 см³; колифаги – в 100 см³. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде.

Общее микробное число воды (ОМЧ) – количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при 37 ⁰С в течение 24 часов.

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37⁰С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые, кроме этого способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 ⁰С в течение 24 часов.

Сульфитредуцирующие клостридии (преимущественно Clostridium perfringens) – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре в течение 24 часов при температуре 44 ⁰С.

Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18±2 часа при температуре 37 ⁰С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов.

Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами.

9.1.4 Контроль оборудования, трубопроводов, посуды, инвентаря, вспомогательных и упаковочных материалов, рук работников

Контроль аппаратов и оборудования. Контроль проводят непосредственно после мойки, дезинфекции и пропаривания перед началом работы.

Для проведения исследования готовят ватные или марлевые тампоны, которые закрепляют на деревянном или металлическом стержне и помещают в пробирки с 10 см³ воды. Пробирки с тампонами стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 20-30 минут. Смывы с крупного оборудования и аппаратов берут с помощью нержавеющих металлических трафаретов с вырезанной серединой (площадь выреза 10, 25 или 100 см³). Перед взятием пробы трафарет смачивают спиртом, обжигают и накладывают на исследуемую поверхность. Ограниченную поверхность промывают смоченным тампоном, затем тампон погружают в пробирку с водой и содержимое хорошо перемешивают. В смывной воде определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки (путем посева на МПА и среду Кесслера). В смывах с хорошо вымытого оборудования общее количество микроорганизмов в смывной воде не должно превышать их содержания в чистой воде, поступающей на мойку. Кишечные палочки должны в смыве отсутствовать. Количество слизеобразующих бактерий не должно быть более 0-5 в 1 мл смыва.

Наличие кишечной палочки можно определить, используя среду Кода. В этом случае тампоном, смоченным в среде Кода, промывают исследуемую поверхность. Далее тампон погружают в среду, а пробирку помещают в термостат с температурой 42⁰С на 18-24 часа. О наличии кишечной палочки судят по изменению цвета среды с зеленого до желтого.

Контроль трубопроводов, рукавов, шлангов

Внутренняя поверхность трубопроводов, рукавов, шлангов недоступна для взятия проб с помощью тампонов. В этом случае общую бактериальную обсемененность и коли-индекс определяют в последней промывной воде. Эти показатели не должны отличаться от показателей воды, применяемой в производстве.

Качество мойки трубопроводов можно также оценить путем отбора 10 мл смывной воды в стерильную посуду с последующим центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут и микроскопированием осадка в 10 полях зрения. При этом должно обнаруживаться не более 5-6 клеток микроорганизмов.

Контроль посуды и инвентаря

Для анализа санитарного состояния стеклянных бутылок и банок смыв делают путем обмывания внутренней поверхности последовательно 10 единиц посуды 20 см³ воды. Санитарное состояние бочек, бидонов, цистерн проверяют путем посева последней смывной воды. Смыв с мелкого инвентаря (мешалки, пробники, термометры и др.) готовят путем смачивания всей поверхности стерильным тампоном, а при анализе санитарного состояния стеллажей, лотков, ведер, лопат пользуются трафаретом. В смывах определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка должна отсутствовать в смывах.

Контроль вспомогательных и упаковочных материалов

Пергамент, фольгу, пленку, комбинированные материалы для упаковки молока и молочных продуктов разворачивают и с внутренней стороны берут смыв стерильным ватным тампоном (со 100 см³ поверхности). Определяют наличие микроскопических грибов и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка в смывах должна отсутствовать, а содержание плесеней не должно превышать 5 в 1 см³ смыва.

Поваренную соль контролируют на общую бактериальную обсемененность. Для разведения берут 5 г соли и растворяют ее в 95 см³ воды. Содержание микроорганизмов в соли не должно превышать 100 КОЕ/г.

Сахар исследуют на наличие дрожжей и плесеней, растворяя 10 г сахара в 90 см³ воды. Дрожжи и микроскопические грибы должны отсутствовать.

Контроль чистоты рук и спецодежды работников

Анализ чистоты рук работников производят (без предварительного предупреждения) пред началом производственного процесса только у рабочих, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией.

Перед анализом тампон смачивают стерильной водой или физиологическим раствором и обтирают им обе руки и пальцы каждого работника. Тампон ополаскивают в воде, в которой проводилось его смачивание, хорошо взбалтывают, отбирают 1 мл и подготавливают разведения (1:10 и 1:100). Для определения общего количества микроорганизмов в 1 мл смыва производят посев разведений на МПА в стерильные чашки Петри и далее проводят термостатирование при 37 ⁰С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в 5 см³ среды Кесслера или Кода, а затем проводят культивирование при температуре 42-43 ⁰С в течение 18-24 часов. Наличие в смыве кишечной палочки недопустимо.

Можно применить и такой метод: в сложенные ладонями вместе кисти рук наливают 100 мл стерильной воды так, чтобы вода хорошо промыла пальцы. Стерильным тампоном протирают ладони и ногти. Воду собирают в стерильную склянку и туда же бросают тампон. Смывную воду перемешивают и производят аналогичные высевы. Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 мл смыва при отсутствии кишечных палочек:

Количество микроорганизмов в 1 мл смыва с рук	Оценка чистоты
До 1000	Отлично
1000-5000	Хорошо
5000-10000	Удовлетворительно
Свыше 10000	Плохо

Периодически проводят контроль обработки рук хлорной известью, для чего отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрахмальным раствором (смесь растворов - 6% раствора йодистого калия и 4% раствора растворимого крахмала в равных соотношениях). Если тампон и поверхности рук в местах соприкосновения с тампоном окрашиваются в сине-бурый цвет, то это свидетельствует о присутствии ионов хлора.

Чистоту рук можно проверить также с помощью индикаторных бумажек для определения бактерий группы кишечной палочки. Для этого индикаторную бумажку смачивают в стерильной воде и накладывают на руку. Затем бумажку помещают в пакет, запаивают и термостатируют в течение 12 часов при 37⁰С. Появление розовых пятен свидетельствует о присутствии БГКП.

Халаты, куртки, передники, перчатки из ткани периодически исследуют на присутствие кишечных палочек посевом 1 см³ смывной воды в среду Кесслера. Кишечные палочки на спецодежде должны отсутствовать.

9.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1-е занятие

На первом занятии студенты знакомятся с методиками определения микроорганизмов в воздухе, воде и осуществляют посевы этих объектов на питательные среды. Готовят смывы с рук и далее проводят определение наличие кишечной палочки с использованием среды Кода.

9.2.1 Микробиологическое исследование воздуха

седиментационным методом

Определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей.

Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см³ мясопептонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на развернутую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была открыта полностью.

Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 37⁰С, а со средой Сабуро – в течение 2-3 суток при 25⁰С.

Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроорганизмов в 1 м³ пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см² оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Формула Омелянского:

Х = а×100×5×100 / ST,

где а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух);

S – площадь чашки Петри, см²;

Т – время экспозиции, мин;

100 – пересчет площади чашки на 100 см²;

5 – время экспозиции по Омелянскому, мин;

100 – пересчет на 1 м³ воздуха.

9.2.2 Микробиологическое исследование воды

Отбор проб

Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см³). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем.

9.2.2.1 Определение общего микробного числа (КМАФАнМ)

Проводят по методике, описанной в разделе 2.2.2.1.

Для посева отбирают по 1 см³ воды и переносят в 2 чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45…50 ⁰С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два.

9.2.2.2 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации выросших колоний.

Для анализа точно отмеряют 100 см³ воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37 ⁰С в течение 24 часов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью.

При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 37 ⁰С для определения общих колиформных бактерий и при 44 ⁰С при определении термотолерантных колиформных бактерий.

9.2.2.3 Определение содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Метод бродильных проб (или титрационный метод) основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду для идентификации выросших колоний.

Титрационный метод может быть использован:

· при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом бродильных проб;

· при анализе воды с большим содержанием взвешенных частиц;

· в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Первый этап исследования заключается в посеве 3-х объемов воды по 100 см³ в концентрированную лактозопептонную среду. Посевы инкубируют при температуре 37 ⁰С в течение 24-48 часов для определения общих колиформных бактерий и при 44 ⁰С – при определении термотолерантных колиформных бактерий в течение 24±2 часов. Если в колбах не обнаружены признаки роста (об этом судят по отсутствию газа в поплавках) то колиформные бактерии отсутствуют в 100 см³.

На втором этапе исследований из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 37 ⁰С в течение 18-20 часов. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды.

9.2.2.4 Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий

прямым посевом

Из каждой пробы воды делают посев 20 см³ в железосульфитный агар. Для этого в стерильные пробирки вносят по 10 см³ в 2 пробирки объемом 30 см³ или по 5 см³ в 4 пробирки вместимостью 15 см³. Посевы заливают горячим (75…80 ⁰С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирки быстро охлаждают, помещая их в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44 ⁰С в течение 24±2 часов. Если после культивирования не наблюдается почернения среды в пробирках, то считают, что сульфитредуцирующие клостридии отсутствуют в 20 см³.

9.2.3 Исследование чистоты рук

Закрепленный на деревянном или металлическом стержне стерильный тампон смачивают стерильной водой (или физиологическим раствором) и протирают ими ладони, тыльную поверхность рук, под ногтями и между пальцами обеих рук. Тампон погружают в пробирку с водой, в которой проводилось смачивание, содержимое пробирки хорошо взбалтывают, отбирают 1 см³ и готовят разведения (1:10 и 1:100).

Для определения КМАФАнМ проводят посев разведений в чашки Петри на мясопептонный агар с последующим термостатированием при 37⁰С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в пробирки с 5 см³ среды Кесслера и проводят культивирование при 43 ⁰С в течение 24 часов.

Учет результатов исследований. Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 см³ смыва при отсутствии газообразования в пробирке со средой Кесслера с поплавком (при отсутствии кишечной палочки). При оценке состояния рук по содержанию в смывной воде мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) руководствуются описанием, изложенным в разделе 4.1.4 данной лабораторной работы.

2-е занятие

На втором занятии студенты исследуют:

- посевы воздуха на мясопептонном агаре и на среде Сабуро. Подсчитывают количество выросших колоний и по формуле Омелянского (раздел 4.2.1.) определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, содержание грибов и дрожжей в 1 м³ воздуха. Определение качественного состава микрофлоры воздуха проводят по методикам, описанным в разделах 2.2.4 и 2.2.5. На основании результатов исследований делаются выводы о санитарном состоянии и качественном составе микрофлоры воздуха.

- посевы водопроводной воды на мясопептонном агаре и среде Кесслера. Подсчитывают количество выросших колоний на мясопептонном агаре. Если в чашках выросло более 50 колоний, то санитарное состояние воды неудовлетворительное. Внимательно рассматривают посевы воды на жидкой накопительной среде (лактозо-пептонной среде или среде Кесслера). Если на среде есть рост, то лаборанты к занятию делают пересев на среду Эндо. Студенты рассматривают посевы в чашках Петри на среде Эндо и при наличии типичных колоний готовят фиксированные мазки, окрашивают их по Граму. Если в мазках при микроскопии с объективом на х90 обнаруживаются грамотрицательные мелкие палочки, располагающиеся по одиночке, без спор, то считают, что в исследуемой пробе воды присутствуют кишечные палочки и делают вывод о том, что исследованная вода не соответствует требованиям СанПиНа и в 100 см³ воды обнаружены общие колиформные бактерии.

- посевы с рук на мясопептонном агаре и среде Кесслера. Делают вывод о чистоте рук согласно описанию, изложенному в разделе 4.2.3.

Контрольные вопросы

1. Какая служба осуществляет государственный санитарный надзор на предприятиях молочной промышленности?

2. Какие формы государственного санитарного надзора Вы знаете?

3. какими полномочиями наделены органы и учреждения государственного санитарного надзора?

4. Кто осуществляет внутриведомственный санитарный надзор на предприятиях молочной промышленности?

5. По каким микробиологическим показателям проводят оценку санитарно-гигиенического состояния воздуха?

6. В чем сущность седиментационного метода определения микроорганизмов в воздухе?

7. В чем заключается сущность аспирационного метода определения микроорганизмов в воздухе?

8. Каким образом можно снизить бактериальную обсемененность воздуха?

9. Какие микробиологические показатели определяются согласно ГОСТу в питьевой воде для оценки ее санитарного состояния?

10. Каким образом готовятся смывы с оборудования для оценки его санитарного состояния?

11. Как проводят контроль чистоты трубопроводов, шлангов, рукавов?

12. Какие микробиологические показатели определяют в смывах с оборудования, трубопроводов, посуды?

13. Каким образом проводят микробиологический контроль вспомогательных и упаковочных материалов?

14. Как определить качество мойки и дезинфекции посуды?

15. Как проводят микробиологический контроль чистоты рук работников?

16. Как проводят контроль обработки рук работников хлорной известью?

17. Как определить содержание микроорганизмов в 1 м³ воздуха?

18. Что такое коли-титр, коли-индекс воды?

19. Какие способы обеззараживания воды Вам известны?

20. Каким образом определяется коли-титр и коли-индекс в питьевой воде?

21. Как рассчитывается содержание микроорганизмов в 1 м³ воздуха при использовании седиментационного метода?

22. Какие микроорганизмы являются санитарно-показательными для воздуха и как они определяются?

1. Вербина Н.М., Каптерева Ю.В. Микробиология пищевых производств: Учебник. – М.: Агропромиздат, 1988. – 256 с.

2. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов».

3. ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа».

4. ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов».

5. ГОСТ 25102-90 «Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий».

6. Королева Н.С. Основы микробиологии и гигиены молока и молочных продуктов. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 168 с.

7. Лерина И.В., Педенко А.И. Лабораторные работы по микробиологии: Учеб. Пособие для товаровед. и технол. фак. торг. вузов. – 2 изд., перераб. – М.: Экономика, 1986. – 128 с.

8. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. – М.: Изд-во стандартов, 1996.

9. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания МУК 4.2.577-96. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. –94 с.

10. Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды: Методические указания МУК 4.2.671-97. – М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1997. –36 с.

11. Микробиологические основы молочного производства: Справочник / Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; Под ред. канд. техн. наук Я.И. Костина. – М.: Агропромиздат, 1987. – 400 с.

12. Микробиология: Практикум / Л.Г. Бранцевич, Л.Н. Лысенко, В.В. Овод, А.В. Гурбик. – Киев: Вища школа, 1987. – 200 с.

13. Микробиология, санитария и гигиена: Учебник для вузов / К.А. Мудрецова-Висс, А.А.Кудряшова, В.П.Дедюхина. Владивосток: Изд-во ДВГАЭУ, 1997. 312 с.

14. Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.: Агропромиздат, 1990. – 223 с.

15. СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». Действительно с 1 января 2002 г. - М.; изд-во стандартов, 2002.

16. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984 – 208 с.

17. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. – М.: Колос, 1996. –271с.

Приложение 1

Дата добавления: 2013-12-11