Методы генетической инженерии растений

Метод кокультивации с агробактерией является одним из самых распространённых методов получения трансгенных двудольных растений.

В качестве исходного материала необходимо иметь штамм агробактерии с векторной конструкцией. Вектор должен содержать последовательность гена, который необходимо ввести в геном растения.

В качестве эксплантов для трансформации обычно берут стерильные листовые диски. Однако можно брать и молодые корешки, семядоли, междоузлия.

Экспланты инокулируют жидкой средой, содержащей агробактерию с векторной конструкцией. Время инокуляции подбирается для каждого вида растений индивидуально. При этом происходит заражение клеток раневой поверхности экспланта, и после 24-48 ч. кокультивирования в некоторых клетках происходит встраивание в растительный геном фрагмента Т-ДНК с чужеродным (выбранным) геном.

Такие трансгенные растения будут расти на среде с добавлением селективного агента. Через 2-5 недель на трансформированном экспланте развиваются побеги, которые в дальнейшем отсаживают или переносят в почву.

Методом кокультивации с агробактериями к настоящему времени получены трансгены растения практически всех сельскохозяйственных двудольных растений. Этот метод применим также и для некоторых однодольных (пшеница, кукуруза, рис).

Методы прямого переноса генов в растение

Для прямого переноса генов в растительные клетки очень часто используется трансформация растительных протопластов. При обработке клеточной стенки растения ферментами (целлюлозой, пектиназой) клеточная оболочка разрушается и остаётся один протопласт. Разработаны методы прямой трансформации протопластов с помощью ДНК.

Для трансформации может быть использован практически ДНК-вектор, несущий чужеродный ген. При этом гибридный ген интегрирует в ядерную ДНК растения и экспрессирует, особенно в случае прямой инъекции в ядро протопласта, используя механизмы клеточной рекомбинации. Однако основным недостатком такого метода является крайне низкая частота трансформации.

В настоящее время более 140 видов растений были протрансформированы путём прямого переноса ДНК вектора в протопластные клетки различными методами:

1) Микроинъекции ДНК. Трансформация растительных протопластов с эффективностью не более 10-15%.

2) Электропорация метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. Метод состоит в следующем: на растительные протопласты, находящиеся в растворе большой концентрации, содержащем ДНК-векторы, действуют высоковольтным импульсом (напряжение 200-350 В). В результате молекулы ДНК поглощаются клетками через поры в клеточной мембране. После разведения раствора протопласты высеиваются на соответствующую среду для регенерации.

3) Упаковка в липосомы. Липосомы – это сферически образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. В настоящее время этот способ трансформации применяется всё реже из-за его технической сложности и низкой трансформирующей активности (0,5- 1%).

4) Метод биобаллистической трансформации. Метод биобаллистики, являясь одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, платины или золота, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформации генную конструкцию. Помещают внутрь биобаллистической пушки, суспензия клеток вносится в чашку Петри и помещается под биобаллестическую пушку. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление. В момент сбрасывания давления вольфрамовые или золотые частички с огромной скоростью выбрасываются из пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Были трансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень.

Дата добавления: 2013-12-12