Методи клонального мікророзмноження

Існує багато методів клонального мікророзмноження, а також різних їх класифікацій. Згідно з однією з них, запропонованою Мурасіге у 1977 році, процес можна здійснювати наступними шляхами:

– активація пазушних меристем;

– утворення адвентивних пагонів тканинами експланту;

– виникнення адвентивних пагонів у каллусі;

– індукція соматичного ембріогенезу в клітинах експланту;

– соматичний ембріогенез в каллусній тканині;

– формування додаткових ембріоїдів в тканині первинних соматичних зародків (поділ первинних ембріоїдів).

Н.В. Катаєва і Р.Г. Бутенко (1983) виділяють два принципово різних типи клонального мікророзмноження:

1. Активація уже існуючих в рослині меристем (апекс стебла, пазушні та сплячі бруньки стебла).

2. Індукція виникнення бруньок або ембріоїдів de novo: а) утворення адвентивних пагонів безпосередньо тканинами експланту; б) індукція соматичного ембріогенезу; в) диференціація адвентивних бруньок в первинній та пересадочній каллусній тканині.

Основний метод, який використовується при клональному мікророзмноження рослин – активація розвитку уже існуючих в рослині меристем. Він базується на знятті апікального домінування.

Цього можна досягти двома шляхами: а) видалення верхівкової меристеми стебла і наступним мікрочеренкуванням пагону in vitro на безгормональному середовищі; б) дадаванням у поживне середовище речовин цитокінінового типу дії, які індукують розвиток численних пазушних пагонів. Як правило, в якості цитокінінів використовують 6-бензиламінопурин (БАП) або 6-фуруфуриламінопурин (кінетик) і зеатин.

Одержані таким чином пагони відділяють від первинного експланту і знову самостійно культивують на свіжоприготоіваному поживному середовищі, яке стимулює проліферацію пазушних меристем і виникнення пагонів в більш високих порядках.

Часто в якості експланту використовують верхівкові або пазушні бруньки, які ізолюють з пагону і поміщають на поживне середовище з цитокінінами. Утворені пучки пагонів ділять, за необхідності черенкують і переносять на свіже поживне середовище. Після кількох пасажів, додаючи в поживне середовище ауксини, пагони вкорінюють in vitro, а потім переносять в грунт, де створюють умови, які сприяють адаптації рослин.

У даний час цей метод широко використовується у виробництві посадкового матеріалу сільськогосподарських культур, як технічних, так і овочевих, а також для розмноження культур промислового квітникарства (наприклад, гвоздики), тропічних і субтропічних рослин, плодових і ягідних- культур, деревних рослин. Для деяких культур, таких як картопля, технологія клонального розмноження поставлена на промислову основу. Застосування методу активації розвитку існуючих меристем дозволяє одержати з однієї меристеми картоплі більше 100000 рослин за рік, причому технологія передбачає одержання в пробірках мікробульб – цінного безвірусного посівного матеріалу.

Другий метод – індукція виникнення адвентивних бруньок безпосередньо тканинами експланту. Він базується на здатності ізольованих частин рослин при сприятливих умовах поживного середовища відновлювати відсутні органи і таким чином регенерувати цілі рослини. Можна домогтися утворення адвентивних бруньок майже з будь-яких органів і тканин рослин (ізольованого зародку, листка, стебла, сім’ядолі, луски і донця цибулини, сегментів коренів і зачатків суцвіть). Цей процес відбувається на поживних середовищах, які містять цитокініни в співвідношення з ауксинами 10:1 або 100:1. В якості ауксину використовують ІОК або НОК. Таким способом було розмножено багато представників родини лілійних, томати, деревні рослини (зі зрілих і незрілих зародків).

Досить добре розроблена технологія клонального розмноження суниці, заснована на культивування апікальних меристем. Меристематичні верхівки ізолюють з молодих, вільних від вірусних хвороб рослин, і вирощують на поживному середовищі МС, яке містить БАП в концентрації 0,1 – 0,5 мг/л. через 3 – 4 тижні культивування меристема розвивається в проросток, в основі яку якого формуються адвентивні бруньки, які швидко ростуть і дають початок новим брунькам. Протягом 6 – 8 тижнів утворюється конгломерат бруньок, які об’єднані між собою сполучною тканиною і знаходяться на різних стадіях розвитку. З’являються листки на коротких черешках, в нижній частині яких формуються нові адвентивні бруньки. Ці бруньки розділяють і пересаджують на свіже поживне середовище. На середовищі без регуляторів росту за 4 – 5 тижннів формуються нормальні рослини з коренями і листками. Від однієї материнської рослини таким чином можна одержати кілька міліонів рослин-регенерантів за рік.

Третій метод, який практикується при клональному мікророзмноженні, базується на диференціації з соматичних клітин зародкоподібних структур, які на вигляд нагадують зиготичні зародки. Цей метод отримав назву соматичного ембріогенезу. На відміну від розвитку in vivo, соматичні зародки розвиваються асексуально поза зародковим мішком і за зовнішнім виглядом нагадують біполярні структури, у яких одночасно спостерігається розвиток апікальних меристем стебла і кореня. Згідно з Стевардом, соматичні зародки проходять 3 стадії розвитку: глобулярну, серцеподібну, торпедоподібну і в результаті мають тенденцію розвитку в проросток.

Найбільш вражаючим застосування методу соматичного емрбріогенезу стало розмноження гвінейської маслинової пальми (Elaeis guineensis), олія якої широко використовується при виробництві маргарину і харчової олії. Маслинова пальма в природі не утворює пагонів і бічних ростків, що ускладнює її вегетативне розмноження. Культивування черенків in vitro також неможливе. Було вирішено одержати сукупність клітин недиференційованої тканини (каллуси) шляхом диференціації специфічних тканин, а потім культивувати їх до регенерації цілих проростків. В першому культуральному середовищі каллуси із фрагментів листків розвивалися протягом 90 днів, при переносі в друге і третє культуральні середовища перетворювались в «ембріоїди». Ембріоїди розмножувались самовільно, протягом місяці кількість ембріоїдів зросла втричі, а за рік з 10 ембріоїдів можна було одержати нащадків в кількості 500000 рослин.

Формування ембріоїдів в культурі тканин здійснюється в кілька етапів. Спочатку відбувається диференціація клітин під впливом ауксинів, доданих в поживне середовище (2,4-Д) і перетворення їх в ембріональні. Одержати ембріоїди з цих клітин можна зменшуючи концентрацію ауксинів або виключаючи їх з поживного середовища. Соматичні зародки являють собою повністю сформовані зародки, з яких шляхом відповідного капсулювання можна одержати штучне насіння.

Четвертий метод клонального мікророзмноження – диференціація адвентивних бруньок в первинній і пересадочній каллусній тканині. Практично він мало використовується з метою одержання посадкового матеріалу in vitro. Це пов’язано з тим, що при частому пасеруванні каллусної тканини може змінюватися плоїдність регенерованих рослин, спостерігаються структурні перебудови хромосом і накопичення генних мутацій. Поряд з генетичними змінами відмічаються і морфологічні: низькорослість, неправильне жилкування листків, утворення вкорочених міжвузлів, понижена стійкість до хвороб та шкідників. В той же час, деякі недоліки цього методу в селекційній роботі стають перевагами.

Крім того в деяких випадках він являється єдиним можливим способом розмноження рослин в культурі тканин. Через каллусну культуру успішно розмножуються цукровий буряк, злакові, представники роду Brassica, соняшник та інші культури.

Дата добавления: 2013-12-12