Методи трансплантації ядер

У СРСР Б.В. Конюховим й Е.С. Платоновим в 1985 р. був розроблений метод менш травматичного переносу ядер методом мікроманіпуляції. Він протікає у два етапи: спочатку тонкою мікропіпеткою проколюють зони пелюциду й плазматичної мембрани й витягають пронуклеуси, а потім іншою піпеткою, більшого діаметра (12 мкм) у той же отвір уводять диплоїдне ядро донора. У цьому випадку менше травмується цитоплазма зиготи й транспортоване ядро донора.

Трансплантація ядер може здійснюватися й іншим способом, з використанням цитохалазинів (речовин, синтезованих грибами).

Цитохалазин В руйнує структуру мікрофіламентів і сприяє унікальному розташуванню ядра. Ядро залишається з’єднаним із клітиною тоненькою стеблинкою цитоплазми. При центрифугуванні цей місток розривається, утворюються без’ядерні клітини (цитопласти) і каріопласти, що представляють собою ядра, оточені тонким шаром цитоплазми й цитоплазматичною мембраною. Цитопласти відокремлюють від інтактних клітин за градієнтом густини. Вони зберігають здатність прикріплюватися до поверхні культуральної судини й можуть бути використані для злиття з каріопластами інших клітин з метою одержання життєздатної клітини.

Методи виділення каріопластів трохи складніші й містять у собі ряд операцій по центрифугуванню, розділенню в градієнті густини й т.д. У деяких випадках до суміші клітин і каріопластів додають частки танталу діаметром 1 – 3 мкм. Вони проникають у клітини й інколи в каріопласт, тому більш важкі клітини осаджуються швидше каріопластів.

Цитопласти містять всі види органел, властиві нормальній клітині, зберігають здатність прикріплюватися до субстрату, утворювати складчасту мембрану, пересуватися, здійснювати піноцитоз.

Каріопласти оточені тонким шаром цитоплазми (близько 10% від всієї клітинної цитоплазми), містять компактний ендоплазматичний ретикулум, кілька мітохондрій і рибосом. У деяких клітинних ліній 1/10 каріопластів здатна відновити весь втрачений об’єм цитоплазми й відновитися в життєздатні клітини.

Для реконструкції клітин суспензію каріопластів у сольовому буфері додають до моношару культури цитопластів із пропорції 100 каріопластів на 1 цитопласт. Цитопласти повинні бути вже покриті інактивованими вірусними частинками. Інкубують при температурі 4ºС 45 хвилин, а потім ще 45 хвилин при температурі 37ºС. Відмивають розчином Ерла для видалення каріопластів, які не злилися.

Дата добавления: 2013-12-12