Параметров токсикометрии

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

2.1. КРИТЕРИИ ТОКСИКОМЕТРИИ

Токсикометрия- это преимущественно экспериментальный раздел токсикологии. Получение количественных оценок действия ксенобиотиков требует реализации трех исследовательских этапов: планирования эксперимента, его проведения и получения количественных оценок, интерпретации результатов. При этом прежде всего учитывают показатели токсичности исследуемого вещества, его потенциальную опасность, концентрации яда в окружающей среде или его дозы (при попадании вещества в организм, например, через рот), способные вызвать отравление.

Чаще всего термин «доза» служит для обозначения количества введенного в организм химического вещества, выражаемого обычно на единицу массы тела.

Величина DL50 имеет вероятностный характер. Некоторые способы определения DL50 основаны на предположении о «нормальности» кривой доза-эффект. В этом случае кроме характеристики положения DL50 статистическая совокупность экспериментальных данных по определению смертельной дозы того или иного вещества должна еще иметь характеристику рассеяния. Такой характеристикой является величина среднеквадратического отклонения (ошибки) - σ _DL50. Следовательно, наиболее определенной, а может быть, и наилучшей количественной характеристикой токсичности яда в зоне смертельных доз будет величина DL50 и ее среднеквадратическа (стандартная) ошибка- σ _DL50.

Если величину DL50 определяют почти всегда, то ее стандартную ошибку σ _DL50 -значительно реже. Это приводит к тому, что существенная часть экспериментально собранной ин формации о токсичности того или иного яда, во-первых, не используется самими авторами, а во-вторых, не может быть использована другими исследователями.

Таким образом, среднесмертельная доза изучаемого вещества должна представляться в виде величины: DL50 + σ _DL50..

Однако токсический эффект определяется не только количеством яда, но и временем его воздействия. Действие ядов в зависимости от дозы или концентрации обычно по-разному развивается во времени. Следовательно, токсический эффект всегда есть результат взаимодействия трех факторов: организма, количества вещества и времени.

Связь между дозой вещества, временем и эффектом может быть представлена в виде поверхности в трехмерном пространстве. При сечении этой поверхности плоскостями, параллельными координатным плоскостям, получаются три семейства кривых, попарно связывающих дозу яда, время и эффект. Эти попарные зависимости между двумя величинами (при постоянном значении третьей, чаще временной величины) и являются предметом исследования токсикологов. В соответствии с числом пар, которые могут быть составлены из трех рассматриваемых величин, принципиально возможны три типа токсикологических экспериментов:

• эксперименты по установлению связи между дозой или концентрацией яда и токсическим эффектом. Такие эксперименты осуществляются наиболее часто. К ним относятся, например, опыты по определению среднесмертельных доз и концентраций;

• эксперименты по установлению зависимостей между временем воздействия яда и эффектом. В ряде случаев зависимости время- эффект имеют большое значение, например, при установлении предельно допустимых концентраций вредных вешеств для атмосферного воздуха;

• эксперименты по установлению связей между дозой или концентрацией яда и временем наступления фиксированного токсического эффекта. Примером экспериментов, относящихся к этому типу, являются опыты по изучению кумулятивных свойств ядов.

Количество яда и величина эффекта, связь которых изучается в опытах трех перечисленных типов, выражаются в соответствующих единицах концентрации или дозы воздействующего вещества. И концентрацию, и дозу вещества можно выразить в долях от дозы или концентрации, вызывающей определенный эффект, например от дозы, вызывающей 50%-ю гибель животных (0,5DL50, 0,1DL50 и т. д.).

Объем эффекта выражают либо количеством животных, на которых достигнут определенный результат в течение определенного срока наблюдения за ними (например, процент гибели животных в течение первых суток после введения яда), либо по среднему результату проявления эффекта (например, по времени гибели половины подопытных животных). В первом случае говорят об альтернативном эффекте, во втором- о градированной (градационной) зависимости эффекта от воздействующего агента. При учете реакции в альтернативной форме для каждого животного достаточно определить наступление или отсутствие эффекта. При учете же результата в градированной форме для каждого животного необходимо установить степень достигнутого эффекта. Понятно, что для учета реакции в градированной форме необходимы более тонкая методика и индивидуальный подход к каждому животному. Таким образом, рассматривая вопрос об изучении зависимостей между дозой яда, временем и эффектом, следует иметь в виду возможность проведения шести видов токсикологических экспериментов: три типа по два варианта в каждом - в зависимости от формы учета эффекта (альтернативной или градированной).

2.2. ПЛАНИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА

Токсический эффект- результат взаимодействия организма и токсиканта. При изучении токсичности веществ необходим всесторонний учет не только особенностей организма, но и исследуемого токсического агента. На этой стадии проводят анализ литературных данных о характере биологического действия, токсичности и опасности известных аналогов изучаемого вещества.

Природа или характер токсического действия, присущего данному химическому веществу, в значительной степени зависит от функциональной группы или групп, входящих в молекулу вещества. Знание реакций, в которые могут вступать эти функциональные группы с реакционно-способными группами критических эндогенных биохимических компонентов, дает возможность прогнозировать характер ожидаемого токсического действия.

По таким физико-химическим константам, как молекулярная масса (Mr), температура кипения (t_кип}, плотность (d), и некоторымдругим можно установить степень корреляции с параметрами токсикометрии. Опираясь на твердо установленные связи между структурой, физико-химическими свойствами и действием изучаемых веществ, можно в известной степени синтезировать близкие по строению и составу вещества.

Однако оценка токсичности на основании аналогии с химически родственными веществами в значительной мере чревата ошибками и требует большого объема токсикологической информации, характеризующей очень близкие по химическому строению вещества.

Даже незначительные различия в химической структуре могут сопровождаться значительными изменениями в токсичности.

Предварительная оценка степени токсичности вещества может быть произведена при однократном введении путем установления верхней и нижней границ диапазона его токсического действия, т. е. смертельной и пороговой доз. Верхний и нижний параметры токсичности определяют зону острого токсического действия. Опасность острого отравления устанавливается шириной этой зоны. Чем она уже, тем более возможно острое отравление.

Верхние параметры токсичности представляют собой смертельные дозы, т. е. количества вещества, которые при введении в организм вызывают гибель определенного количества животных в опытной группе.

Практически определение верхнего параметра токсичности производят на основании анализов результатов испытания рядапоследовательно возрастаюших доз вещества с использованием для каждой дозы определенной группы животных одного вида: от дозы, не вызывающей ни одного случая смерти, до дозы, приводящей к гибели всех животных в группе. Учитывают зависимость между дозой вещества и частотой наступления летального исхода.

В начале острого опыта в первую очередь надо установить, в каких цифровых порядках находятся параметры токсичности. Целесообразно в целях выявления доз, лежащих в зоне летального действия, вначале использовать для каждой дозы не более одногодвух животных. Опыты с необходимым для статистики числом животных начинают от той дозы, при введении которой в ориентировочном опыте живоnюе осталось живым, в то время как от всех более высоких доз животные погибали.

Некоторые ученые рекомендуют в предварительных опытах определять порядок смертельных доз, испытывая дозы, кратные 10 (например, 5, 50, 500, 5000 мг/кг).

Так как для проведения полного опыта по установлению параметров токсичности требуется в общей сложности довольно большое количество животных, то чаще для этой цели используют мышей.

При установлении смертельных параметров для животных других видов можно использовать меньшее количество особей, применив метод Ван дер Вердена.

Испытуемые дозы должны различаться на равные численные значения. При выборе доз обычно прибегают к арифметической прогреесии (например, 1, 2, 3, 4, 5 и т. д. или 5, 10, 15, 20 и т. д.). Но дозы, взятые в арифметической прогрессии, разнятся между собой некратно. Так, дозы 5 и 10 разнятся в 2 раза, а дозы того же ряда 50 и 55 - лишь на 10%. Это заставило некоторых авторов предложить пользоваться при выборе доз геометрической прогрессией (например, 1, 2, 4, 8, 16, 32 и т.д. или 0,1, 0,01, 0,001 и т. д.) или применять ряды Фульда. Эти ряды представляют собой геометрические прогрессии с начальным членом 10 ⁿ и знаменателем ^m 10,

где n- любое целое положительное или отрицательное число, а

m- любое целое положительное число, отличное от нуля.

Удобство этих рядов заключается в том, что они содержат одни и те же соотношения во всех разрядах единиц. Конкретный ряд рекомендуется выбирать в зависимости от количества используемых для опыта животных. Например, для опытов, где каждую дозу испытывают на пяти-шести животных, подходят следующие ряды:

1,0-1,5-2,1-3,2-4,6-8,8-10,0- 15,0;

1,0-1,4-1,9-2,7-3,7-5,2-7,2-10,0-14,0.

Для опытов, в которых дозу испытывают на 10 животных, можно

применить ряды:

1,0- 1,3- 1,8-2,4-3,2-4,2-5,6-7,5- 10,0- 13,0;

1,0-1,3-1,7-2,1-2,8-3,6-4,6-6,0-7,7- 10,0 -13,0;

1,0- 1,3-1,6-2,0-3,2-4,0-5,0-6,3-8,0 -10,0.

После того как приблизительное значение эффективных доз найдено, приступают к основному эксперименту. Подопытных животных разделяют на равные по численности группы – по 6-10 животных в каждой группе. На каждой группе испытывают одну дозу. Всего испытывают пять-восемь доз, доходя с одной стороны до дозы, не вызывающей учитываемой реакции ни у одного из животных в группе, и с другой стороны до дозы, вызывающей эту реакцию у всей группы животных. Во всех случаях желательно, а для некоторых методов необходимо, чтобы интервал между испытываемыми дозами был постоянным. Следует стремиться к тому, чтобы весь опыт был проведен в течение одного дня. Если это невозможно, то рекомеНдуют ежедневно испытывать весь ряд доз на меньшем количестве животных.

При изучении токсичности следует считать обязательным правилом вскрытие каждого погибшего животного, с тем чтобы исключить из эксперимента животных, смерть которых могла наступить не из-за действия токсического агента. Так, при внутрибрюшинном введении вещества возможно повреждение кровеносных сосудов, о чем будет свидетельствовать значительное количество крови в брюшной полости. В случае введения таксиканта внутрижелудочно возможно повреждение пищевода или ошибочное введение вещества в трахею.

В результате эксперимента исследователь получает данные о количестве животных, у которых под влиянием испытанных доз вещества наблюдалась или не наблюдалась учитываемая реакция. Эти данные заносят в таблицу, в которой результат эксперимента обычно записывают в виде дроби: в числителе указывают число животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция, в знаменателе - число животных, у которых эта реакция не наблюдалась, либо общее число животных в группе.

2.3. МЕТОДЫ РАСЧЕТА

СРЕДНЕЭФФЕКТИВНОЙ ДОЗЫ ТОКСИКАНТОВ

Среднесмертельную дозу вычисляют статистическими методами. Наиболее известны методы Беренса, Кербера, Першина, Беренса и Шлоссера, метод наименьших квадратов, методы пробитанализа Миллера и Тейтнера, Лигчфилда и Уилкоксона, метод Штабекого и некоторые другие.

При выявлении эффективной дозы какого-либо вещества, вызываюшего конкретный эффект, находят не одно определенное значение, а ряд значений, которые образуют вариационный ряд его индивидуальных эффективных доз. Распределение частот индивидуальных эффективных доз в этом вариационном ряду обычно приближается к нормальному распределению.

В условиях нормального распределения вариационный ряд может быть полностью определен средней арифметической варьирующего признака (в данном случае -доза) и величиной стандартного отклонения (σ), соответствующего стандартной ошибке средней арифметической (σ) из индивидуальных минимальных эффективных доз. Найти ее можно, используя известную формулу:

где X- значение отдельного наблюдения; Х ср -средняя арифметическая вариационного ряда; n - число наблюдений.

Другой путь определения средней эффективной дозы вытекает из особенностей кривой нормального распределения. Площадь над осью абсцисс, ограниченная этой кривой, выражает общее количество животных, у которых наблюдалась изучаемая реакция (рисунок 1, А).

Рисунок 1- Соотношение между кривой нормального распределения (А) и соотвестсвующей ей кумулятивной (Б)

Так как кривая нормального распределения симметрична, то перпендикуляр, восстановленный из точки х, соответствующей средней эффективной дозе, разделит всю площадь, ограниченную кривой, на две равные части. Следовательно, средняя эффективная доза вместе с тем является той дозой, которая вызывает изучаемый эффект у 50 % подопытных животных.Итак, вместо того, чтобы на очень большом количестве животных определять эффективные дозы и из них вычислять среднюю арифметическую, можно избрать более простой путь - искать ту дозу, которая вызывает изучаемый эффект у 50% подопытных животных.

Если изучать на животных действие последовательно возрастающих доз исследуемого вещества, разделив для этого животных на ряд групп и испытывая на каждой группе какую-либо одну дозу, то окажется, что учитываемая реакция проявляется лишь начиная с какой-то определенной дозы, частота возникновения этой реакции будет нарастать и, наконец, при какой-то величине дозы эта реакция наступит у всех животных данной группы. Зависимость между величиной дозы и частотой возникновения реакции можно изобразить графически. Для этого по оси абсцисс следует отложить дозы, а по оси ординат - частоту возникновения учитываемого эффекта к числу животных, на которых данную дозу испытали (рисунок 1, Б). При этом зависимость между дозой и частотой наступления реакции будет представлена симметричной S-образной кривой, которую обычно называют кумулятой или характеристической кривой. На этой кривой средняя эффективная доза соответствует значению абсциссы для той части кривой, ордината которой равна 50%.

Для стандартизированной кривой нормального распределения, т. е. при ста1щартном отклонении теоретического распределения при σ = -1, следует отметить, что при σ = -1 площадь, отсекаемая перпендикуляром, восстановленным из этой точки, составляет 16% (точнее, 15,87 %) общей площади, ограниченной кривой распределения; при σ = + 1 отсекаемая площадь составляет 84% (точнее, 84,13 %) общей площади, ограниченной кривой распределения.

Следовательно, доза вещества, которая меньше, чем DL50, на величину стандарта, должна вызывать реакцию у 16 % животных, доза, превышающая DL50 на величину стандарта, должна вызывать реакцию у 84 % животных. Эти дозы соответственно обозначают

DL16 и DL84·

Итак, DL16 = DL50 - σ; DL84 = DL50 + σ.

Отсюда: DL84 - DL16 = DL50 + σ - DL50 + σ = 2 σ, следовательно, σ = (DL84 - DL16)/2.

Это соотношение часто используется для нахождения стандартного отклонения и стандартной ошибки DL50.

Характеристическая кривая имеет исключительно большое значение для количественной оценки фармакологической активности. По существу, все методы количественного определения активности сводятся к построению характеристической кривой или эквивалентной ей прямой на основании данных, полученных в результате эксперимента, и к последующему их анализу.

2.2.3.1. МЕТОД БЕРЕНСА

Метод вычисления DL50 по Беренсу основывается на том положении, что общее количество животных, погибших от доз, меньших DL50, равно общему количеству животных, выживших от доз, больших DL50.

Для обработки экспериментального материала по методу Беренса необходимо, чтобы интервал между испытываемыми дозами бьш одинаков и чтобы для испытания каждой из доз было использовано одинаковое количество животных. Для выравнивания экспериментальной характеристической кривой Беренс предложил прием так называемого накопления частот. Этот прием заключается в том, что к числу животных, погибших от каждой из испытанных доз, прибавляется количество животных, погибших от всех меньших испытанных доз, а к числу животных, выживших от каждой из испытанных доз, прибавляют количество животных, выживших от всех более высоких испытанных доз.

Логически этот прием вполне оправдан. Так, если данное животное погибло под влиянием какой-то дозы изучаемого вещества, то оно, несомненно, погибло бы, если бы это вещество было введено в более высокой дозе; наоборот, если данное животное осталось в живых после введения ему определенной дозы изучаемого вещества, то оно, бесспорно, выжило бы, если бы это вещество было ему введено в меньшей дозе.

На основании вычисленных накопленных частот подсчитывают смертность от каждой из испытанных доз в процентах и строят характеристическую кривую, откладывая по оси абсцисс испытанные дозы, а по оси ординат- проценты смертельных исходов. Величина D L50 может быть найдена непосредственно из графика. Для этого из той точки характеристической кривой, которой соответствует 50 % смертельных исходов, опускают перпендикуляр на ось абсцисс; величине DL50 соответствует точка пересечения этого перпендикуляра с осью абсцисс.

Близкую по значению величину DL50 можно получить и без построения графика. Так как в средней части характеристической кривой небольшой ее отрезок мало отличается от прямой линии, то величину DL50 можно вычислить путем прямолинейного интерполирования между ближайшими к DL50 меньшей и большей дозами.

Если интервал между испытr.нными дозами равен d, а величина DL50 находится между А и В, из которых доза А вызвала а % смертельных исходов (а < 50) и доза В- b % смертельных исходов (b >50), то

Практическое использование метода Беренса можно проиллюстрировать на примере обработки экспериментального материала по изучению токсичности тубазида, подробно описанного М. Л. Беленьким (1963).

Процесс обработки представлен в таблице 1.

Доза, мг/кг	Фактический результат	Накопленные частоты	Смертность, %
	0/8 1/7 4/4 6/2 7/1 8/0	0/22 1/44 5/7 11/3 18/1 26/0	6,7 41,7 78,6 94,7

В первой колонке таблицы указаны испытанные дозы изучаемого вещества, во второй - фактический результат (в числителе - число погибших животных, в знаменателе - выживших), в третьей - результат накопления частот и в четвертой колонке - процент смертельных исходов, рассчитанный на основании данных третьей колонки. «Накопление частот» происходит следующим образом. Для дозы 150 мг/кг, от которой фактически выжило 8 животных, записываем результат: погибло 0 животных, выжило 8 + 7 + 4 + 2 + 1 = 22 животных, т. е. прибавляем к числу фактически выживших животных число животных, которые выжили от более высоких доз. Для дозы 160 мг/кг, от которой в эксперименте 1 животное погибло и выжило 7: погибло 1 животное, выжило 7 + 4 + 2 + 1 = 14 животных. Для дозы 170 мг/кг, от которой погибло в эксперименте 4 животных: погибло 4 + 1 = 5 животных, т. е. прибавляем одно животное, погибшее от меньшей дозы, выжило 4 + 2 + 1 = 7 и т. д. На основании вычисленных по накопленным частотам процентов смертельных исходов строим характеристическую кривую. Из этой кривой находим, что интересующая нас величина DL50 равна 172,3 мг/кг.

Как уже указывалось ранее, величину DL50 можно определить, не прибегая к построению графика, непосредственно из данных, находящихся в 1-й и 4-й колонках расчетной таблицы 1, по указанной ранее формуле. В нашем случае d = 10, А= 170 мг/кг, В=180мг/кг, а =41,7%, b =78,6%.

Следовательно:

= 170+

Дата добавления: 2013-12-12