Культура клеток и тканей

1. Принципы in vitro культивирования

Культивирование in vitro базируется на тотипотентности. Метод in vitro в растениеводстве по – другому называется метод культивирования изолированных клеток и тканей или метод культуры изолированных клеток и тканей. Метод предусматривает использование стандартного оборудования, препаратов, проведение исследований круглый год, независимо от климатических условий, занимая незначительные площади. Метод развивается в трех направлениях:

1) Создание суспензионных культур клеток для получения препаратов медицинского, пищевого назначения для выделения ценных вторичных продуктов, используемых в парфюмерии, гомеопатических средствах;

2) Размножение и оздоровление посадочного материала от вирусов и других патогенов;

3) Использование культуры клеток в клеточной селекции, в генетической инженерии

2. Техника культивирования

Необходимым и обязательным условием является соблюдение строгой стерильности. На биофабриках различают несколько специализированных помещений, где происходит работа с питательными средами – это асептические помещения, где систематически проводится обработка всех поверхностей дезинфицирующими растворами (перекись водорода, хлорамин, медный купорос). Этиловый спирт используют для обработки столов в боксах перед началом работы и после её окончания. При этом тампон, предварительно погруженный в спирт, поджигают, и стол обрабатывают горящим пламенем. В боксе постоянно присутствуют спиртовки, предназначенные для обжига инструментов и посуды. В асептических помещениях стерильность воздуха обеспечивается использованием бактерицидных ламп (кварцевание); могут быть установлены ламинары (бактерицидные камеры), где стерильность обеспечивается миллипорывыми фильтрами. Перед боксами устраивают предбоксники, где также требуется соблюдение стерильности.

Работники лаборатории используют спецодежду при работе в боксах, при этом халаты, повязки, перчатки, бахилы, комбинезоны должны проходить стерилизацию. Стерилизацию проводят в автоклавах (стерилизаторах) при температуре 120 С, давлении 0,75 – 1 атмосфера в течение 40 минут.

Питательные среды подвергают стерилизации в режиме: t -120 C, давление 0,75-1 атмосфера, время 20 минут.

Питательные среды могут иметь компоненты, которые распадаются при термическом воздействии. Если вещества в таком режиме разрушаются, то стерилизацию отдельных компонентов среды проводят с использованием бактерицидных фильтров. После такой стерилизации компоненты вводят в основную стерильную питательную среду, охлажденную до 40 ⁰ С.

Стеклянную посуду, некоторые металлические инструменты обворачивают оберточной бумагой или фольгой, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при t 160⁰ в течение 2-х часов.(потому что здесь была питательная среда)

Отобранные фрагменты растений тщательно, используя щетки, губки, промывают мыльным раствором. Споласкивают дистиллированной водой, на несколько секунд погружают в 70%-ный этиловый спирт (семена погружают на 1-2 минуты). Далее используют стерилизующие растворы (растворы сулемы, диацида, гипохлорита натрия или кальция, перекись водорода). В зависимости от качеств ткани экспланта в растворах выдерживают от 1 до 40 мин. После стерилизации экспланты промывают стерильной дистиллированной водой.

Если экспланты содержат инфекцию, их инкубируют в питательных средах с антибиотиками. Наблюдают в течение 2 недель, при этом выбраковывают чашки, загрязненные ростом бактерий или грибов

3. Питательные среды

Питательные среды включают: макроэлементы – азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо; микроэлементы – бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.; витамины, углеводы, фитогормоны или их аналоги, некоторые вспомогательные вещества, способствующие усвоению компонентов среды (хилаты)

В качестве источника углевода используют глюкозу или сахарозу 2-3%. В качестве источников ауксинов используют дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 Д). кроме этого, индолилуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК). В качестве цитокининов используют бензиламинопурин (БАП), кинетин.

Среда Мурасига и Скуга/ М-С – универсальная среда.

Твердые среды содержат вещество, получаемое из водорослей, агар-агар. Это полисахарид, уплотняющий питательную среду, чем его больше, тем плотнее среда.

Для рационального использования компонентов сред растворы солей микро и макроэлементов, витаминов, фитогормонов готовят более концентрированными, хранят в холодильнике, при необходимости многократно используют в разведениях.

4. Условия культивирования

Для получения каллуса не нужен свет, т.к. каллусные клетки питаются гетеротрофно (готовыми питательными соединениями). В некоторых случаях свет используют на последних этапах развития каллусной ткани для ускорения морфогенеза тканей.

Если каллусная ткань дифференцирована к морфогенезу, ткани переносят на свет, культивируют при освещенности в 1000-4000 люкс (лк). Микроразмножение растений (культивирование пробирочных растений) проводят при освещенности 1000-10000 лк., при этом учитывают фотопериод, требуемый для данной культуры. Влажность комнаты (культуральной камеры) должна составлять 60-70%. Оптимальная температура для большинства культур in vitro 25-26⁰ , для тропических культур 29⁰ . понижение температур до 18 используют для индукции к морфогенезу

15.09

Преимущество метода культуры изолированных клеток и тканей:

· Независимость от внешних условий

· Оптимизация и стандартизация условий выращивания

· Автоматизация и компьютеризация процессов

· Возможность выращивания исчезающих видов растений

Поверхность питательной среды глянцевая.

Состав питательной среды: углеводы, агар-агар (для уплотнения среды), экстракты (солодовые, дрожжевые), эндоспермы незрелых зародышей (каштана или кокосов), макро- и микроэлементы, химические соединения, способствующие дифференциации ткани (нитрат серебра, нитрат аммония), гормоны, ауксины и цитокинины.

Каллусная ткань возникает на агаризованной среде и может быть использована для регенерации из неё растений. Эта ткань может быть использована для получения суспензионной культуры. Каллусные клетки, культивируемые в жидкой среде, создают суспензию, её поддерживают в условия сбалтывания и аэрации.

Культура одиночных клеток – культура, получаемая из уникальных клеток. Из каллуса можно выделить отдельные клетки, получить протопласты (клетки, лишенные клеточной оболочки); в свою очередь протопласты используются в генетической и клеточной инженерии для получения уникальных клеток со специфическим сочетанием генов и хромосом. Одиночные клетки с уникальными свойствами модно выделить – поместить в чашку купрака с обогащенной питательной средой, по истечении 7-10 суток полученный клон пересаживают в обычную среду Мурасига и Скуга (М-С), где продолжают культивирование, получают каллусную ткань. Через 3-4 недели часть клеток продолжают культивировать и половину клеток используют для кариологического анализа. По результатам кариотипирования, приходят к заключению о качественном состоянии биоматериала.

Условия культивирования заставляют клетки делиться под влиянием ауксинов и цитокининов. Этот ритм постоянного деления клеток приводит к повышению вероятности митотических повреждений. При длительном культивировании каллусные ткани постепенно вытесняются исходные диплоидные клетки, тетраплоидными, гексаплоидными, которые могут обладать метаболическими преимуществами. Кроме того в каллусной культуре наблюдают анеуплоидные клетки, клетки несущие генные мутации. Так формируются генетический полиморфизм (разнообразие) клеточной популяции.

Каллусные клетки сохраняют способность синтезировать продукты вторичного метаболизма в условиях питательной среды. Если эксплант отобрать у лекарственного растения, то в стационарной стадии развития каллусной ткани (суспензионной культуры) можно фиксировать синтез алкалоидов, гормонов, других биологически активных соединений, которые можно выделить в чистом виде из питательной среды и изготовить препарат медицинского, с/х-ного, пищевого назначения. Кроме того каллусные клетки сохраняют реакцию на свет, температуру, засоления, воздействие токсикантов.

К Продуктам вторичного синтеза относят фенолы, алкалоиды, терпеноиды, стероиды. Эти вещества второстепенны для клеток, но необходимы для обеспечения связи между тканями органами, для организма в целом, для развития популяции.

Продукты первичного обмена: белки, углеводы, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, липиды. Первостепенные вещества необходимые для жизнеобеспечения клетки.

Фенольные соединения подразделяются на: оксибензойные кислоты, кумарины, флавоноиды. Эти вещества обладают специфическим запахом, используются в парфюмерии. Кроме того, среди них есть красители, их используют для окрашивания тканей. К терпеноидам относятся метанол, изопрен, каучук (производство шин и напольных покрытий), авенастерин (для получения декоративной косметики), бетаин.

Факторы, влияющие на накопление вторичных метаболитов: состав питательной среды, на которой выращиваются культуры (углеводы, гормоны, предшественники); длительность и интенсивность освещения; действие мутагенов; клеточная селекция (отбор наиболее продуктивных клеток).

Микроорганизмы образуют вторичные продукты обмена. Накопление вторичных соединений зависит от возраста микроорганизмов, состава среды, температуры и др.факторов.

Основные требования для получения вторичных метаболитов:

­ Хорошая скорость роста в ферментерах

­ Стабильность роста

­ Максимальное использование питания из среды культивирования

­ Минимальный синтез побочных соединений

­ Высокий доход продукта и быстрое его накопление

21.09.11

Дата добавления: 2013-12-12