Методы in vitro

Партеногенез in vitro – включает получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом (геномов) родителей утрачивается один из геномов. Ядра не сливаются в гибридной клетке, одно из ядер распадается. Яйцеклетка делится с образованием зародыша, в котором отражаются признаки лишь одного генома.

Гиногенез – получение гаплоидных растений из изолированных семяпочек. Любая клетка зародышевого мешка с гаплоидным числом хромосом может индуцировать зародыш в условиях питательной среды.

Андрогенез – развитие зародыша и возникновение гаплоидных растений из незрелых пыльцевых зерен. Для эксперимента отбирают незрелую пыльцу, в которой не проходят митотические деления, т.е. используют микроспоры сразу после мейоза

5) криосохранение растений. это сохранение клеток и тканей растений в жидком азоте при t – 196⁰ . при разработке технологий криосохранения предусматривают применение криопротекторов (веществ, способствующих сохранению целостности клеток при замораживании. Эти вещества используют при подготовке клеток и тканей к замораживанию и в момент замораживания) В качестве криопротекторов выступают осмотики (ПЭГ полиэтиленгликоль, Манит, сорбит), может использоваться глицерин и другие полимерные соединения. На подготовительном этапе выбирают мелкие клетки, которые культивируют в питательной среде с осмотиком. Осмотики отнимают свободную воду, что в значительной мере определяет судьбу клетки при замораживании. Клетки при культивировании насыщают аминокислотами, в частности пролином, который принимает участие в плотном связывании молекул воды. Особое внимание уделяют промежутку замораживания от 0 до -40⁰ . Скорость замораживания обычно составляет 1⁰С/мин. медленное замораживание и использование криопротекторов освобождает клетку от свободной воды, клетки полностью обезвоживаются, затем биоматериал погружают в жидкий азот. Если замораживание осуществляют медленно, то размораживание проводят как можно быстрее, ампулы помещают в водяную баню при t 40⁰ , и выдерживают до полного исчезновения кристалликов льда. Жизнеспособность клеток выявляют с помощью витального окрашивания красителем Эванса /мителеновая синь. Если клетки живые, то они не окрашиваются красителем, мертвые клетки впитывают краску как губка. Для определения репродуктивного потенциала клеток, их высевают на агаризованную среду и наблюдают за появлением колоний.

5) Соматическая гибридизация – гибридизация соматических клеток (клеток тела), чаще всего используется для получения отдаленных гибридов неполовым путем. Метод включает выделение протопластов из экспланта или суспензионных культур(каллусных клеток); слияние протопластов; распознание и изолирование гетерокариоцитов, их культивирование; кареологический анализ клеточной популяции. На первом этапе с использованием ферментов (ксилоназа) разрушают клеточную оболочку, при этом клетка приобретает шарообразную форму, способность захватывать из окружающей среды отдельные органоиды, а также сливаться с себе подобными. Клетка без клеточной оболочки – протопласт. Протопласт может сохранять жизнеспособность в питательной среде, в которую внесены маннит или сорбит. Эти вещества поддерживают асматическое давление в клетке. Со временем протопласт может восстановить клеточную оболочку и дать начало клеточному клону.

После слияния протопластов возникает гетерокарион, при этом протопласты должны происходить от разных видов растений. Если протопласты происходят от одного вида растения возникает гомокарион. после восстановления клеточной оболочки возникают гетероциты и гомоциты, которые могут размножаться и формировать клеточные клоны. Из клеточных клонов гетерокариоцитов возникают отдаленные гибриды, или аллополиплоиды. Из клеточных клонов гомокариоиоцитов возникают автополиплоидные организмы. Для того, чтобы индентифицировать гетерокариоциты, можно использовать маркирование с помощью органоидов клетки.

Рис.1

Маркирование возможно и с помощью флуоресцентного окрашивания. Гибридные клетки гетерокариоциты изолируют в чашки Купрака с питательной средой. Питательная среда, в которой культивируют одиночные клетки, обогащена конденсирующим фактором. Конденсирующий фактор не может быть получен синтетическим путем, поэтому используют питательную среду, в которой ранее культивировали каллусные клетки. В течение 2-3 недель возникает клеточный клон, которые переносят на среду для каллусо-образования и продолжают дальнейшее культивирование. Через 2-4 недели часть клеток исследуют, распознавая кариотип, определяя происхождение хромосом и делают заключение о перспективности гибридной популяции. Если в процессе исследования выявляется сегрегация/ распад хромосом одного из геномов, то клеточную популяцию выбраковывают (данная комбинация геномов бесперспективна из-за несовместимости). Слияние протопластов возможно без воздействия индукторов, но эти события происходят редко. Протопласты имеют отрицательный заряд и отталкиваются друг от друга. Чтобы повысить вероятность слияния протопластов, в среду вносят асмотик ПЭГ, ионы кальция, при этом среда должна быть щелочной. В отличие от гибридов, цибриды содержат лишь одно ядро и гибридную цитоплазму. Метод цибридизации используется для передачи новому поколению клеток цитоплазматических признаков другого вида растения. В результате из таких клеток получают аналоги исходного вида, но с измененным качеством цитоплазмы. Так можно предвнести ДНК митохондрий, пластид свободной ДНК цитоплазмы, которые участвуют в формировании фотосинтетических реакций, дыхательных процессов, формирование ответной реакции на патогены, химический, физический типы стресса в формировании репродуктивного потенциала.

Методы биотехнологии позволяют ускорить получение растений с признаком ЦМС (цитоплазматической стерильности), с признаками повышенной фотосинтетической активности ассимилирующего аппарата (площадь листовых пластинок).

Дата добавления: 2013-12-12