Хроматография

Гибридный аналитический метод – сочетается разделение и определение, причем оба процесса органически связаны.

Применение хроматографических методов для разделения белков оказало огромное влияние на развитие современной биохимии, фармацевтики, криминалистики, терапевтического мониторинга в связи с ростом нелегального употребления наркотиков, идентификации антибиотиков, допинг-контроля, анализа наиболее важных классов пестицидов.

Это важнейший аналитический метод. Более 10 работ, выполненные с применением хроматографических методов, были удостоены Нобелевских премий.

Хроматография – это физико-химический метод разделения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной.

Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое вещество (сорбент) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество; подвижной фазой – жидкость или газ.

Подвижную фазу, вводимую в слой неподвижной фазы, называют элюентом, а подвижную фазу, выходящую из колонки и содержащую разделенные компоненты, – элюатом.

Компоненты анализируемой смеси (сорбат) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ee обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой.

B зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (по какому-либо механизму) компоненты перемещаются вдоль колонки с разной скоростью.

Одни компоненты остаются в верхнем слое сорбента, другие, с меньшей степенью взаимодействия с сорбентом, оказываются в нижней части колонки, некоторые покидают колонку вместе с подвижной фазой. Таким образом компоненты разделяются.

Предложил хроматографию русский ботаник M.C. Цвет. Ha колонке, заполненной CaCO₃, он разделял пигменты растений. Подвижной фазой служил диэтиловый эфир. Именно этим методом он обнаружил, что в экстракте зеленых листьев содержится 2 хлорофилла, 4 ксантофила и каротин.

Классификация хроматографических методов:

– по агрегатному состоянию подвижной фазы – газовая и жидкостная;

– по механизму распределения – адсорбционная, распределительная, ионного обмена;

– по технике выполнения – колоночная, плоскостная.

Вид хроматограммы для наиболее распространенного типа хроматографии – элюентной, при которой пробу вводят в поток подвижной фазы (элюента). Элюент (раствор или растворитель) обладает меньшей сорбируемостью, чем любое из разделяемых веществ. Затем в колонку вводят разделяемые вещества, растворенные в элюенте, и продолжают непрерывно пропускать элюент. При этом разделяемые вещества перемещаются вдоль колонки с разными скоростями в соответствии с их сорбируемостью. На выходе из колонки сначала появляется наименее сорбируемый компонент, затем следующий компонент и т.д. В этом случае

Элюентная хроматограмма (сорбируемость веществ увеличивается в ряду A < B < C)

В любой хроматографической системе происходит обратимый переход молекул вещества А из подвижной фазы (ПФ) в неподвижную фазу (НФ)

А_пф ó А_нф

Хроматографический процесс характеризуется зависимостью концентрации вещества в элюенте от времени хроматографирования (хроматограмма), которая характеризуется следующими параметрами:

Параметры хроматограммы:

t_R – время удерживания; W – ширина пика

Хроматограмма является носителем качественной и количественной информации.

Время удерживания t_R – качественный параметр. Совпадение величин времени удерживания неизвестного и стандартного соединений свидетельствует о том, что эти соединения могут быть идентичными.

Площадь хроматографического пика) S или высота хроматографического пика h являются количественными параметрами.

Устройство газового хроматографа может быть представлено следующим образом:

1 – газовый шприц для ввода образца;

2 – мембрана;

3 – обходной клапан;

4 – баллон с газом-носителем;

5 – колонка;

6 – детектор

Обязательно компьютер и банк хроматографических данных.

Колонки бывают металлические, стеклянные, пластиковые, капиллярные колонки из плавленного кварца (прямые, спиральные и другие колонки длиной от 1–2 м и менее до нескольких десятков метров). Колонок и детекторов может быть несколько.

В качестве адсорбентов используют оксид алюминия, силикагели, активированные угли, пористые полимеры на основе стирола, дивинилбензола и т.д. и синтетические цеолиты.

Жидкостный хроматограф для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ):

1 – подвижная фаза;

2 – фильтр;

3 – насос;

4 – термостат;

5 – колонка;

6 – детектор

Насос по определенной программе подает элюент в хроматографическую колонку. Для обеспечения высокой скорости анализа насосы создают давление до 40 МПа. Проба через специальное устройство (инжектор) вводится непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку вещество детектируется проточным детектором.

B отличие от газа, который выполняет только транспортную функцию и не сорбируется подвижной фазой, жидкая подвижная фаза - активный элюент, молекулы которого могут сорбироваться на поверхности. При прохождении через колонку находящиеся в элюенте молекулы интересующего нас компонента должны вытеснить молекулы элюента с поверхностного слоя сорбента.

Селективность в жидкостной хроматографии, в отличии от газовой, определяется не одним, а двумя факторами – природой подвижной (элюент) и неподвижной фаз.

B стеклянную колонку длиной 1-2 м, заполненную сорбентом, вводят анализируемую пробу и пропускают элюент. Размер зерен сорбента 5-30 мкм. Для таких сорбентов необходимо принудительное нагнетание элюента через колонку. Этот метод называется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Метод может использоваться для:

разделения молекул (твepдo-жидкocтная и жидкость-жидкостная хроматография),

разделения и определения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная),

разделения макромолекул (эксклюзионная).

Дата добавления: 2013-12-13