Приборы, посуда, реактивы

Задание

Микроскоп и техника микроскопирования

Цель работы:

1. Ознакомиться с устройством светопольного микроскопа; овладеть методами работы с ним.

2. Ознакомиться с правилами работы с культурами микроорганизмов, методами приготовления прижизненных и фиксированных препаратов микроорганизмов.

1.Ознакомиться с устройством светопольного микроскопа любой марки, которая имеется в лаборатории и правилами работы с ним.

2. Изучить правила работы с микроорганизмами и методы приготовления прижизненных и постоянных препаратов микроорганизмов.

3. Приготовить препараты «раздавленная капля» клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Промикроскопировать препараты с объективами 8x, 40x и 90х. Зарисовать при увеличении 40x.

4. Приготовить фиксированные препараты:

а) из клеток дрожжей рода Saccharomyces,

б) из бактериальных клеток рода Bacillus, Micrococcus. Промикроскопировать и зарисовать при увеличении 40x.

Домашнее задание

Подготовить ответы на контрольные вопросы, поставленные в конце работы

Микроскоп и осветитель; микробиологическая петля; предметные стекла обезжиренные; покровные стекла; стерильные пипетки на 1-2мл; капельница с водой; хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага; спиртовка; стеклянные шпатели; культуры микроорганизмов; красители (метиленовый синий, раствор Люголя), капельница с 96% спиртом; дезинфицирующий раствор.

1. Светопольная микроскопия. Устройство микроскопа.

Невооруженным глазом рассматриваются предметы чаще всего с расстояния так называемого лучшего видения – 250 мм. При нормальной остроте зрения глаз может на этом расстоянии различать детали размером не менее 0,15 мм. Размеры микробных клеток могут быть менее 0,1 мм. Для наблюдения более мелких деталей необходимо использование специальных средств. Такими средствами являются лупа и микроскоп.

Подавляющая часть объектов исследований не обладает самосвечением, поэтому их необходимо освещать посторонним источником света. При микроскопировании прозрачных объектов применяется проходящий свет, для непрозрачных объектов – отраженный. В микроскопических исследованиях используют освещение по методу светлого и темного поля.

При освещении объекта по методу светлого поля лучи из осветительной системы, пройдя через прозрачный предмет (проходящий свет) или отразившись от поверхности непрозрачного предмета (отраженный свет), поступают в объектив и создают изображение менее прозрачных участков объекта в виде темных участков на светлом фоне.

Все световые биологические микроскопы отечественного производства условно можно разделить на три группы: микроскопы биологические упрощенные, микроскопы биологические рабочие, микроскопы биологические исследовательские.

Среди существующих моделей современных микроскопов наиболее распространены МБР (-1, -2, -3) и т.д. Микроскопы системы МБР последних выпусков носят название «Биолам» - Биолам Р (-1, -2, -3) и т.д.

Они предназначены для исследования препаратов в проходящем свете в светлом поле.

Принципиальной и наиболее распространенной моделью этой группы является микроскоп Биолам (рис.1)

Рис.1 Биологический микроскоп:

1 — ножка, 2 — основание штатива, 3 — тубусодержатель, 4 — тубус (наклонный), 5 — предметный столик, 6 — зажимы, 7 — окуляр, 8- объективы, 9 — револьвер, 10 — зеркало, 11 — конденсор, 12 — кремальера 13 — микрометрический винт.

1.1 Устройство микроскопа.

Микроскоп состоит из механической и оптической частей. Механическая часть микроскопа включает штатив, предметный столик, тубус (труба). Штатив состоит из основания и тубусодержателя, который имеет форму дуги. Тубусодержатель с увеличительной оптикой приводят в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов. Макрометричекий винт перемещает тубусодержатель вверх и вниз на 50 мм.

Макрометрический винт (кремальера, зубчатка, макровинт) служит для предварительной, ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта.

Микрометрический винт (микровинт) используют для получения последующего более четкого изображения. При полном повороте микрометрического винта тубус передвигается на 0,1 мм (100 мкм). При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается по направлению к препарату, при вращении против нее идет от препарата, однако полных оборотов микровинтом делать не следует, вначале необходима грубая настройка. У некоторых микроскопов микрометрический винт размещается в ножке штатива.

На предметный столик помещают препарат с объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается при помощи двух, находящихся справа и слева, винтов в горизонтальной плоскости на 8 мм. В центре столика находится отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направленными зеркалом микроскопа. В центре столика вмонтированы два зажима (клеммы) – пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления препарата.

Тубус – это оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней его части прикреплено револьверное устройство (объективодержатель), состоящее из двух пластин. Нижняя пластина вращается и имеет гнезда для объектива, верхняя закреплена неподвижно. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика. Наклонный тубус можно повернуть вокруг вертикальной оси в любое удобное положение и закрепить винтом. Внутри наклонного тубуса, в нижней его части, помещена призма. В верхний конец тубуса вставляется окуляр. Модели микроскопа Биолам - (3,4) и т.д. имеют бинокулярный тубус.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата(зеркало, светофильтры, ирисовая диафрагма, конденсор)иувеличительной оптики (объективы и окуляры).

Осветительный аппарат находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая – вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться только плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений.

Конденсор (от лат. condenso – уплотняю, сгущаю) состоит из двух-трех короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим прежде всего при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз в пределах 20 мм специальным винтом, расположенным справа. Все линзы в микроскопах скреплены специальным веществом – канадским бальзамом.

Правила работы с конденсором. При увеличении 8х, 40х конденсор находится в нижнем и среднем положении. При большем увеличении (90х) конденсор находится в верхнем положении.

Для регулирования интенсивности освещения в конденсор вмонтирована ирисовая диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок.

Правила работа с диафрагмой. Чтобы получить более четкое изображение исследуемого объекта, регулируют степень раскрытия диафрагмы. Окрашенные препараты лучше всего рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные – при уменьшенном отверстии диафрагмы.

Под конденсором располагается откидная оправа для светофильтра (обычно к микроскопу прилагаются синее и матовые стекла). При работе с искусственным источником света светофильтры создают впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.

Объектив (от греч.objectum – предмет исследования) – наиболее важная часть микроскопа. Он дает действительное, увеличенное и обратное изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату называется фронтальной Она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов. Один из таких недостатков – следствие явления сферической аберрации. Это явление связано со свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В результате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.

Хроматическая аберрация возникает при прохождении через линзу пучка лучей различной длины волны. Преломляясь по-разному, лучи пересекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.

К объективам, устраняющим сферическую аберрацию и частично хроматическую, относят ахроматы. Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Края поля зрения при использовании ахроматов бывают окрашены в разные цвета спектра. Ахроматы широко распространены вследствие своей простоты и дешевизны. Объективы, устраняющие хроматическую аберрацию почти в 10 раз, по сравнению с ахроматами, называются апохроматами. В их составе может быть до 8 линз. Объективы – планохроматы содержат до 12 линз, которые корректируют и сферическую, и хроматическую аберрации. Их используют при микрофотографировании.

Микроскопы системы МБР снабжены ахроматическими объективами. Исключение составляет Биолам Р-4, где наряду с ахроматами имеются планохроматические объективы.

Объективы бывают сухие и погруженные, или иммерсионные.

При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает работу с ними при погружении фронтальной линзы объектива в однородную жидкую среду. При работе с сухими объективами вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя (рис.2,3).

Рис.2. Ход лучей в сухой и иммерсионной системах

I... V – лучи света

Рис.3. Схема хода лучей при разной величине угла u: А – объект;

О – объектив; α – отверстный угол; u – половина отверстного угла

При работе с иммерсионным объективом (рис.4) между покровным стеклом и линзами объектива помещают кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. Кедровое масло получают из семян виргинского можжевельника Juniperus virginiana L. или заравшанской арчи Juniperus scravschana Kom. Последнее время иммерсионной жидкостью чаще служат синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу. Лучи в оптически гомогенной среде не меняют направления.

Рис.4. Влияние иммерсионного масла на ход лучей в микроскопе:

1 – объектив; 2 – предметное стекло; 3 – объект; 4 – иммерсионное масло;

5 – лучи света; 6 – фронтальная линза объектива

На оправе иммерсионных объективов есть черная круговая нарезка и обозначения: I - immersion (иммерсия), HI – homogen immersion (однородная иммерсия), OI – oil immersion (МИ – масляная иммерсия).

Обозначения увеличений объективов наносят на их оправу. Каждый объектив характеризуется, кроме того, определенной величиной рабочего расстояния в миллиметрах.

У объективов с малым увеличением расстояние от фронтальной линзы объектива до препарата (объекта) больше, чем у объективов с большим разрешением (табл.1). В связи с этим необходимо строго следить, каким винтом – макрометрическим или микрометрическим – пользоваться при фокусировке объектива. У объективов с увеличением 8х, 40х и 90х рабочие расстояния соответственно равны 8,3; 0,6 и 0,15 мм. Кроме того, каждый объектив характеризуется определенной величиной фокусного расстояния. У объективов с увеличением 8х, 40х, 90х фокусные расстояния равны соответственно 18,2, 4,35 и 1,96 мм.

Таблица 1

Оптическая характеристика объективов к микроскопу МБР - 1

Объективы	Собственное увеличение	Числовая апертура	Фокусное расстояние, мм	Свободное рабочее расстояние, мм	Видимое поле зрения с окуляром 10х, мм
Сухие системы 8 х 0,20 40 х 0,65		0,20 0,65	18,2 4,35	8,91 0,60	1,75 0,35
Иммерсионные системы 90 х 1,25		1,25	1,96	0,15	0,15

У объективов малых увеличений не только большие рабочие расстояния, но и большие поля зрения. В связи с этим рекомендуется начинать исследование препарата с небольшого увеличения.

Объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной 0,17 + 0.1 мм. Если стекло не соответствует стандарту, необходимо регулировать объектив вращением кольца коррекционной оправы, которой оснащены современные высококачественные объективы. При отсутствии такой оправы сферическую аберрацию, вызываемую покровным стеклом, следует устранить, поднимая или опуская тубус микроскопа.

Окуляр микроскопа представляет оптическую систему, состоящую из двух линз: глазной (верхней) и собирательной (нижней). Между линзами в окуляре есть диафрагма, которая задерживает боковые лучи и пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие более контрастное изображение. Назначение окуляра состоит в увеличении того изображения, которое дает объектив. Имеются окуляры, увеличивающие в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз. Увеличение окуляра указано на оправе, например 15х.

Дата добавления: 2013-12-13