Принцип секвенирования ДНК методом химической деградации по максаму-гилберту

В основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Условием проведения секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу. Разделение продуктов деградации по размеру с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, способного разделять фрагменты ДНК, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид в широком диапазоне. Определить нуклеотидную последовательность секвенированного участка ДНК позволяет последующая радиоавтография геля.

Сначала проводится ограниченная модификация определенных нуклеотидов под действием различных химических агентов. Концентрация агента и продолжительность его воздействия на молекулы ДНК подбирается с расчетом, чтобы в каждой молекуле произошла модификация только одного нуклеотида, а поскольку в реакционной смеси присутствует огромное количество таких молекул, то, согласно теории вероятности, все основания данного типа в секвенируемом фрагменте ДНК окажутся модифицированными. Следующие этапы удаления модифицированных оснований и р-элиминации обоих фосфатов, окружающих дезоксирибозу, и разрыва цепи должны проходить уже количественно. Отдельные реакции ограниченной модификации и количественного расщепления проводят для каждого типа нуклеотидов или их комбинации. Таким образом, в результате четырех (или иногда трех, пяти или даже шести) типов реакций образуется смесь олигонуклеотидных молекул, которые различаются по размеру на один нуклеотид и несут на одном из концов метку, обычно радиоактивную. Также кроме меченых молекул в реакционной смеси будут находится, и фрагменты, не несущие метки, но они окажутся невидимыми на этапе радиоавтографии. Восстановить последовательность нуклеотидов секвенируемого фрагмента ДНК можно после разделения продуктов реакции в дорожках денатурирующего полиакриламидного геля и этапа радиоавтографии. На рентгеновской пленке будет видна лестница из полос ДНК.

На рисунке 1 в виде схемы показан процесс определения последовательности нуклеотидов ДНК данным методом.

Дата добавления: 2013-12-13