Методи дослідження в цитогенетиці

Хромосомний комплекс виду з усіма його особливостями: числом хромосом, їх формою, наявністю видимих в світловий мікроскоп деталей будови, генним і алельним складом називається каріотипом. Всі живі організми мають постійне число специфічних хромосом в кожній соматичної клітці. Диплоїдне число хромосом (2n) для людини - 46, для дрозофіли - 8, для коня - 66, шимпанзе - 48, собаки - 78 і т. д. Гаплоїдне число (n) для людини - 23, дрозофіли - 4 і т. д. Гамети зазвичай містять тільки один набір хромосом. Число хромосом у каріотипі індивідуума не залежить від рівня організації виду і не вказує на філогенетичну спорідненість, тому що одна і та ж кількість хромосом може зустрічатися у дуже далеких один від одного видів. Особливість проявляється в тому, що кожен вид організмів має специфічний набір хромосом певної форми і розмірів. А головне, хромосоми організмів різних видів мають свій унікальний набір генів, що визначають розвиток індивідуумів тільки певного виду.

Центральним завданням при проведенні цитогенетичного аналізу є визначення каріотипу. Каріотипування - це відправна точка всього дослідження, яка визначає можливість застосування всіх інших методичних підходів.

Найбільш простий метод фарбування хромосом, званий в даний час суцільним або рутинним, застосовують для визначення кількості хромосом в препараті і виявлення геномних мутацій і анеуплоїдій. При цьому забарвленні використовують барвник Гимзи, який рівномірно фарбує хромосоми по всій довжині, що дає можливість ідентифікувати хромосоми і оцінити їх кількість на препараті. Цей метод забарвлення успішно застосовувався до 70-х років минулого століття і дозволив виявити етіологію більшості хромосомних синдромів, що характеризуються зміною кількості хромосом. В даний час суцільне фарбування застосовують, в основному, для виявлення кількісних аномалій каріотипу, а також специфічного сайту ламкості при синдромі фрагільної X-хромосоми. Препарат метафазних хромосом людини, забарвлених по всій довжині, представлений на малюнку. Проте використання рутинного методу забарвлення не дозволяє виявляти структурні перебудови хромосом.

У цих випадках застосовують спеціальні методи, так званого диференційного забарвлення, в результаті якого хромосоми набувають поперечну посмугованість. Розташування та товщина темних і світлих смуг строго індивідуальні для кожної хромосоми, що дозволяє проводити їх точну ідентифікацію і виявляти структурні перебудови. Для пояснення виникнення різного зафарбування смуг на хромосомах висувається кілька гіпотез: відмінності в кількісному змісті А- Т і G –С - пар основ, особливості будови нуклеосом, а так само асинхронність реплікації різних ділянок ДНК. Найбільше поширення отримав простий і ефективний G- метод диференціального фарбування (G - бендінг) який розробив в кінці 1960-х років Т. Касперсон. В основі методу лежить набуття хромосомами патерну зі світлих і темних смуг по всій довжині при обробці їх трипсином з подальшим забарвленням барвником Гімзи. Процедура фарбування займає від 5 до 10 хвилин і призводить до появи специфічного для кожної хромосоми малюнка поперечної посмугованості. Показано, що кількість смуг в метафазних і прометафазних пластинках істотно різниться: у метафазних пластинках їх число досягає 400, а в прометафазних - від 800 до 1000. Препарат метафазних хромосом людини, пофарбованих за G- методом, представлений на малюнку.

Рис. Каріотип людини при простому (а) и диференційному (б) зафарбуванні

Характер посмугованості специфічний для кожної пари хромосом. Темні смуги (G - смуги, G - бенди) утворюються в місцях локалізації інтерстиціального гетерохроматину. Такі ділянки практично не містять повторів ДНК і багаті А-Т-парами. У прометафазі, коли хромосоми знаходяться на ранній стадії конденсації, можна нарахувати до 2000 смуг, по друге випадках - 400-800 смуг Цей спосіб фарбування дозволяє ідентифікувати хромосоми, виявляти делеції, інверсії, инсерции, транслокації, ламкі місця і більш складні перебудови. Фарбуванню по G - методом передує попередня обробка цитогенетичних препаратів. Залежно від методики це може бути інкубація в буферах, що не містять Ca^{2 +} і Mg^{2 +} при t ° <= 37 ° С або t °> = 60 ° С; інкубація у розчинах протеолітичних ферментів (трипсин, пепсин та ін); інкубація з депротеінезуючими речовинами (сечовина, 2-меркаптоетанол); інкубація в стандартному сольовому розчині (SSC) під впливом лугу і високої температури.

Існують різні методики G - диференціального фарбування хромосом, але зазвичай використовується GTG (попередня обробка трипсином, фарбування барвником Гімзи). Вплив трипсину забезпечує перехід регулярної спіралеподібної структури в нерегулярну сегментацію, що перешкоджає сприйняттю барвника Гімзи в G - негативних ділянках і підсилює його в G - позитивних сегментах хромосом.

Інші методи забарвлення використовуються рідше внаслідок їх складності або вузької специфічності. R-метод обумовлює сегментацію хромосом, протилежну тій, яка має місце при забарвленні G-методом. С-метод диференційного забарвлення дозволяє аналізувати лише деякі райони хромосом - ділянки так званого конститутивного гетерохроматину, локалізованого в навколоцетромерних районах довгих плечей хромосом 1, 9 та 16, в довгому плечі Y-хромосоми людини, а також у коротких плечах акроцентричних хромосом. Для диференційного забарвлення хромосом можуть використовуватися флуорохроми: акрихін, акрихін-іприт, квінакріном та інші (Q-метод забарвлення). За результатами диференціальної флюоресценції ідентифікують кожну пару гомологів, а за світінням Y-хроматину визначають наявність Y-хромосоми в інтерфазних ядрі.

Поява нових технологій молекулярної цитогенетики, заснованих переважно на in situ гібридизації нуклеїнових кислот, значно розширило можливості хромосомної діагностики.

Завдяки успіхам молекулярної генетики людини розроблено принципово новий метод вивчення хромосом - метод флюоресцентної гібридизації in situ (FISH). Принцип цього методу полягає в наступному (схема):

Рис. Схема подвійної специфичної флюоресцентної гібридизації in situ

Для досліджуваної хромосоми або конкретної її ділянки, виходячи з специфічності послідовності основ ДНК, готують однониткову ділянку ДНК, до якої приєднується біотин або дігоксігенін (1). Така «позначена» ділянка ДНК називається зондом. На мікроскопічному препараті in situ при лужній обробці хромосомна ДНК денатурується, тобто розриваються зв'язки між двома нитками ДНК. Зондом обробляють препарат. Оскільки послідовність основ ДНК - зонда і відповідної ділянку хромосоми взаємно комплементарні, то зонд приєднується до хромосоми. У цій ділянці відбувається ренатурація ДНК. Після цього препарат обробляють речовиною (2), яка завдяки своїй структурі здатна вибірково приєднатися до біотину або дігоксігеніну. Як видно на схемі, для біотину такою речовиною є стрептовідін, для дігоксігеніна - антідігоксігенінове антитіло. До цих речовин можуть бути приєднані в один або два етапи (3, 4) флюоресцентні барвники (родамін - червоний колір або флюоресцеїн ізотіоцианат - зелений колір). За допомогою люмінесцентного мікроскопа пофарбовані хромосоми візуалізуються на тлі нефарбованих.

Межі застосування методу FISH дуже широкі: від локалізації гена до розшифровки складних перебудов між кількома хромосомами. Слід підкреслити, що поєднання молекулярно-генетичних і цитологічних методів робить майже необмеженими можливості діагностики хромосомних аномалій, як дуже складних, так і дуже дрібних за розмірами.

У клінічній цитогенетиці метод FISH займає все більше місце. У випадках складних хромосомних перебудов, які захоплюють більше двох хромосом, диференціальна G- забарвлення не завжди дозволяє ідентифікувати змінені сегменти хромосом. У цих випадках застосовують триколірний варіант методу FISH. Наприклад, у дитини з множинними вродженими аномаліями при G- аналізі виявлені складні перебудови в 6 хромосомах (1,4. 7, 8, 9 і 12) з 10 розривами. Повна ідентифікація розривів можлива тільки за допомогою FISH - забарвлення. Метод FISH може застосовуватися для діагностики анеуплоїдій в інтерфазних ядрах. Принцип методу в цьому варіанті такий же, як і для метафазних пластинок (описаний вище). Наприклад, специфічний для хромосоми 21 зонд ДНК, з’єднаний з біотином, гібридизують з денатурованими клітинами амніотичної рідини на предметному склі. У нормі, тобто якщо у плода є дисомія по хромосомі 21, в ядрі будуть видні дві флюоресцентні відповідним кольором точки. Якщо у плода трисомія, то в ядрі будуть видні 3 точки. Такий методичний прийом називають інтерфазної цитогенетикою. Метод простий, економічний і потребує мало часу (кілька годин).

Рис. Метод FISH у діагностиці анеуплоїдій в інтерфазних ядрах

Метод порівняльної геномної гібридизації (CGH - comparative genome hybridization). Область використання методу - онкологічна цитогенетика. Призначення методу - визначення районів хромосом, які делетуються або амплифікуються в певному типі пухлини. Райони делецій, як правило, містять гени - супресори пухлинного росту, а райони ампліфікації містять онкогени. Таким чином, метод використовується більшою мірою для картування та клонування генів, залучених в канцерогенез. Іноді буває досить складно отримати хромосомні препарати хорошої якості з солідної пухлини або у хворих з гематологічними онкозахворюваннями, тому був розроблений оригінальний метод непрямого аналізу хромосом в пухлині. Суть методу CGH полягає в тому, що з пухлини виділяють ДНК і мітять її певним флюорохромом. ДНК, виділену з нормальної тканини, мітять іншим флюорохромом. Хромосомні препарати готують стандартним способом з лімфоцитів периферичної крові контрольного індивіда. Мічену ДНК з пухлини і незміненій тканини гібридизують з хромосомним препаратом. За інтенсивністю світіння мітки визначають області делецій і ампліфікації. Ділянка роздільної здатності -5-10 млн пар нуклеотидів. Для обробки даних використовують програми комп’ютерного аналізу хромосом.

Дата добавления: 2013-12-14