Лекция № 16-17. І. Тема:Ферментационное оборудование

І. Тема: Ферментационное оборудование. Биореакторы (инокуляторы, ферментаторы и др.) и общие принципы аппаратурного оформления процессов культивирования биообъектов.

Способы обеспечения аэрации и перемешивания при культивировании продуцентов. Проведение ферментационного процесса для продуцентов-анаэробов.

ІІ. Цель: Ознакомить студентов с ферментационным оборудованием, видами биореакторов, общими принципами аппаратурного оформления процессов культивирования биообъектов.

ІІІ. Тезисы лекции:

Высокая производительность биотехнологических способов производства целевых продуктов с заданными свойствами обусловлена способностью микроорганизмов, культуры тканей или клеток к интенсивному размножению, т.е. быстрому наращиванию биомассы. В результате этого происходит накопление целевых продуктов в биомассе или в культуральной жидкости.

По способу проведения глубинное культивирование различают:

· В периодическом режиме.

· Непрерывно в проточном режиме.

Глубинное культивирование проводят в аппаратах, называемых ферментаторами или ферментерами.

Ферментеры, используемые в периодическом режиме, делятся на:

· Барботажные;

· Эрлифтные (англ. – аir – возду, lift - поднимать).

· Барботажно-эрлифтые;

· С механическим перемешиванием;

· Барботажные с циркуляционным перемешиванием;

· С эжекционной системой и др.

При проведении глубинного культивирования непрерывно в проточном режиме используемые ферментеры по принципу действия делятся на:

а) Хемостаты; б) Турбидостаты.

Для каждого биотехнологического процесса должна быть разработана подходящая схема, а сам процесс должен постоянно наблюдаться u1080 и тщательно контролироваться. Для большинства практических биотехнологических процессов такими системами являются ферменторы или биореакторы, которые обеспечивают необходимые физические условия, способствующие наилучшему взаимодействию катализатора со средой и поставляемым материалом. Биореакторы варьируют от простых сосудов до весьма сложных систем с различным уровнем компьютерного оснащения.

Биореакторы изготавливаются в двух вариантах или типах. Первый тип для нестерильных систем, когда нет абсолютной необходимости оперировать с чистыми культурами микроорганизмов (например, ферментация при пивоварении, производство пекарских дрожжей и т. п.).

Биореакторы второго типа предназначены для асептических процессов, обычно используемых в производстве таких соединений как, антибиотики, аминокислоты, полисахариды и одноклеточный бактериальный белок. В реакторах такого типа все посторонние микроорганизмы должны быть исключены, что, естественно, связано со значительными сложностями при их конструировании и разработке самого биотехнологического процесса.

Основное требование к биореакторам любого типа сводится к обеспечению оптимальных условий роста продуцента или накоплению синтезируемого им продукта. Для достижения указанных целей необходимо разрабатывать технологию, призванную оптимизировать процесс, а именно: использовать подходящий источник энергии, набор питательных веществ должен соответствовать питательным потребностям организма-продуцента, из ростовой среды должны быть удалены соединения, ингибирующие его жизнедеятельность, должна быть подобрана соответствующая посевная доза и, наконец, обеспечены все остальные требуемые физико-химические условия. Экономически рентабельные процессы в своей основе весьма сходны, независимо от избранного продуцента, используемой среды и образуемого продукта.

Главная задача – получение максимального количества клеток с одинаковыми свойствами при их выращивании u1074 в определенных тщательно контролируемых условиях. Фактически один и тот же биореактор (лишь с небольшими изменениями) может быть использован для производства ферментов, антибиотиков, органических кислот или одноклеточного белка.

Другим существенным различием между биотехнологическими и химическими процессами является необходимость создания аэробных или анаэробных условий, требуемых для культивирования соответствующего организма. Поэтому в определенных случаях необходимо подавать кислород и удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую очередь двуокись углерода (СО₂).

Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны обеспечить баланс между расходом О₂ и его поступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не одинакова на различных стадиях культивирования.

Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в биореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры. Поддержание температуры в определенном узком диапазоне диктуется:

1) резким снижением активности ферментов по мере падения температуры и

2) необратимой инактивацией (денатурацией) макромолекул (в первую очередь белков) при ее повышении до критических значений.

Температурный оптимум у каждого организма лежит в определенных пределах. Большинство биотехнологических процессов осуществляется в мезофильных условиях (30–50 0С). С одной стороны, это имеет преимущество, потому что лишь в редких случаях приходится обеспечивать повышенный подогрев реакторов. Однако, с другой стороны, возникает проблема удаления избыточного тепла, выделяющегося при интенсивном росте культивируемых клеток, поэтому биореактор должен быть оснащен эффективной системой охлаждения. Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ) продукты распада жиров (мыла) и белки (составные компоненты субстрата например, белки соевой и кукурузной муки и т. п.). Образующийся слой пены опять же, с одной стороны, способствует росту аэробных микроорганизмов, а с другой – сокращает полезный объем реактора и способствует заражению культуры посторонней микрофлорой. Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения.

Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания. Иными словами, в биотехнологическом производстве важное место отводится принципу асептики, выдвинутому еще в 60-е годы XIX в. Луи Пастером.

В последнее время в биотехнологию внедряется принцип дифференцирования режимов культивирования: разные этапы одного и того же процесса осуществляются при различных условиях – температура, рН, аэрация и т. п. Естественно, это создает новые (дополнительные) требования при конструировании реакторов. Таким образом, в соответствии с основными принципами реализации биотехнологических процессов современные биореакторы должны обладать следующими системами:

• эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания;

• обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов системы (аэрирование в первую очередь);

• теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температуры внутри реактора и ее контролируемые изменения;

• пеногашения;

• стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры;

• контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины – так называемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т. п. так называемые вторичные метаболиты).

Довольно широко в биотехнологии используется периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества либо порциями, либо непрерывно "по каплям".

Существует также отъемно-доливочное культивирование, когда часть содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное "омолаживание" (обновление) культуры и задерживает (отдаляет) ее переход в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным культивированием.

Модификацией периодического культивирования является культивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу.

В непрерывных процессах культивирования клетки постоянно поддерживаются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор непрерывно подается свежая питательная среда и обеспечивается отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования.

При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая система возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление u1089 свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижается концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является (после серии затухающих колебаний) установление равновесия между скоростью роста культуры и ее разбавлением.

Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Его конструкция предусматривает наличие:

1) приспособления для подачи питательной среды;

2) устройства, обеспечивающего отток культуральной жидкости вместе с клетками,

3) системы, контролирующей концентрацию элементов питательной среды и управляющей скоростью подачи питательной среды.

Последнее является наиболее важным и наиболее сложно осуществимым устройством.

Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространенным методом ее определения является измерение светорассеивания с помощью фотоэлементов. Повышение концентрации клеток и соответственно оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот. По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь системами контроля скорости протока.

Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малым протоком, когда концентрация клеток изменяется незначительно с изменением скорости протока, что облегчает саморегулировку системы. Область использования турбидостатов – высокие скорости разбавления, обусловливающие быстрое и резкое изменение концентрации биомассы. С технической точки зрения турбидостат может применяться только для культивирования одноклеточных микроорганизмов. При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу. Однако имеются и определенные преимущества. Так, например, если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения от массивного заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм.

Непрерывное культивирование в одном биореакторе называется одностадийным. Многостадийное выращивание предусматривает последовательное или каскадное расположение биореакторов, позволяющее обеспечивать внедрение принципа дифференцированных режимов в непрерывные биотехнологические процессы, основанные на создании системы биореакторов.

При разработке новых биотехиологических процессов сначала прибегают к периодическому культивированию. На непрерывный режим пока еще переведено небольшое число процессов, однако перспективность его не вызывает сомнений, несмотря на более сложные конструкции аппаратов и систем контроля (иными словами, на более солидные капиталовложения).

Конечно, и периодическое культивирование еще не исчерпало своих возможностей. Пока что выбор режима (периодическое или непрерывное культивирование) подчиняется (да и будет подчиняться в дальнейшем) соображениям экономической целесообразности.

Тщательное перемешивание культурной среды – один из ниболее распространенных процессов в БТ. Перемешивание необходимо для:

- равномерной доставки питательных веществ к клеткам;

- предотвравщения накопления токсических побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом участке биореактора.

Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую культуру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиолическое тепло, выделяемое микроорганизмами в процессе бисинтеза, способствуют гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов масса- и теплообмена.

Конструкция меалки игоает важную роль в работе биореактора. Мешалки делят на быстро- и тихоходные. Быстроходные аппараты с большой и средней циркуляционной производительностью используют в препаратах с отражательными перегородками (отбойниками). Отсутствие перегородок приводит к завихрению жидкости, снижению скорости у стенки аппарата и образованию воронки.

- Мешалки быстроходные – турбинные, пропеллерные, лопастные, дмсковые. Тихоходные – якорные, рамные, ленточные, вибрационные, скребковые; последние для перемешивания средне- и высоковязких сред. Для глубинного культивирования чаще всего используют турбинную мешалку с прямыми лопастями, расположенными радиально.

- Перемешивание культуральной среды влияет на другие параметры:

- скорость переноса кислородного из пузырьков газа в жикую среду, из среды – в клетки;

- эффективность теплопередачи;

- точность измерения концентрации метаболитов культуральной жидкости;

- эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных и т.д.).

Следует соблюдать баланс между необходимостью тщательного перемешивания среды и целостностью клеток, так как при чрезмерном перемешивании в среде могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток.

Непрерывный моноторинг всех параметров, дает возможность изменять условия в ходе ферментации. Как правило, оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора.

Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую культуру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиологическое тепло, выделяемое микроорганизмамаи в процессе биосинтеза, способствуют гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов масса- и теплообмена.

Конструкция мешалки играет важную роль в работе биореактора. Мешалки делят на быстро и тихоходные. Быстроходные аппараты сбольшой и средней циркуляционной производительностью используют в препаратах с отражательными перегородками (отбойниками). Отсутствие перегородок приводит к завихрению жидкости, снижению скорости у стенки аппарата и образованию воронки.

Мешалки быстроходные – турбинные, пропеллерные, лопастные, дисковые. Тихохдные – якорные, рамные, ленточные, вибрационные, скребковые; последние для перемешивания средне- и высоковязких сред. Для глубинного культивирования чаще всего используют турбинную мешалку с прямыми лопатями, расположенными радиально.

Дата добавления: 2014-01-04