Химические методы иммобилизации ферментов

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что вследствие химических взаимодействий в молекуле фермента возникают новые ковалентные связи, в частности между ним и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, получаемые с использованием химических методов, обладают, по крайней мере, двумя существенными достоинствами. Во-первых, формирующаяся ковалентная связь между ферментом поносителем обеспечивает высокую прочность образующих конъюгатов. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств (субстратной специфичности, каталитической активности и стабильности).

Существует большое число химических реакций, используемых для ковалентного связывания ферментов с неорганическими носителями (такими, как керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природными полимерами (такими, как сефароза и целлюлоза), а также синтетическими полимерными веществами (нейлон, полиакриламид и другие виниловые полимеры или сополимеры, обладающие реакционно-способными группами).

Во многих из этих процедур ковалентное связывание ферментов с носителем является не специфичным, т. е. ассоциирование фермента с носителем осуществляется за счет химически активных группировок фермента, распределенных по его молекуле случайным образом. Основным является создание техники конъюгирования, при которой ферменты связывались бы с носителем достаточно эффективно, но без снижения их каталитической активности. Короче говоря, химическая иммобилизация ферментов в целом является своеобразным искусством, уровень которого определяется качествами экспериментатора.

Для получения иммобилизованных ферментов используют большое количество различных как органических, так и неорганических носителей. Основные требования, предъявляемые к материалам которые могут служить для иммобилизации ферментов, следующие:

· высокая химическая и биологическая стойкость,

· высокая механическая прочность;

· достаточная проницаемость для фермента и субстратов,
большая удельная поверхность, высокая пористость;

· возможность получения трубок, листов и т.п.;

· легкая активация (переведение в реакционноспособную форму);

· высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции
связывания с ферментом в водной среде;

· невысокая стоимость.

Отсутствие в природе универсальных носителей, обладающих сразу всеми перечисленными свойствами, обусловливает широкий набор применяемых для иммобилизации ферментов материалов.

Органические полимерные носители

Используемые в настоящее время органические носители можно разделить на два класса: 1 - природные полимеры, 2 - синтетические полимерные носители. Первые, в свою очередь, подразделяются на группы в соответствии с их биохимической классификацией: полисахаридные, белковые и липидные носители. Синтетические полимеры также могут быть подразделены на несколько групп: полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные носители.

Помимо вышеупоминавшихся требований, к рассматриваемым носителям предъявляются дополнительные, обусловленные методом иммобилизации, свойствами иммобилизуемого фермента, а также способом дальнейшего использования получаемого препарата:

· при ковалентной иммобилизации носитель должен связываться только с теми функциональными группами на молекуле фермента, которые не являются ответственными за катализ;

· носители не должны оказывать ингибирующего действия на фермент.

Применение природных полимеров в качестве носителей аргументируется их доступностью и наличием свободных функциональных групп, легко вступающих в разнообразные химические реакции, а также их высокой гидрофильностью. К недостаткам следует отнести неустойчивость к воздействию некоторых микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них.

Полисахариды

Наиболее часто для иммобилизации ферментов используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности и наличием большого числа гидроксильных групп, что обусловливает ее легкое модифицирование путем введения различных заместителей. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют, что делает ее относительно дешевым и удобным для иммобилизации различных ферментов носителем. Гранулированная целлюлоза легко превращается в различные ионообменные производные. Однако она неустойчива к действию сильных кислот, щелочей и некоторых окислителей, что ограничивает области ее применения.

Хитин - природный аминополисахарид, напоминающий некоторым образом целлюлозу и является компонентом наружного скелета ракообразных, насекомых, а также входит в состав оболочек некоторых грибов. Являясь отходом промышленной переработки креветок и крабов, данное соединение имеется в достаточно больших количествах при относительно низкой стоимости. Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических растворителях. Путем обработки щелочами хитин превращается в хитозан, который в качестве носителя дает хорошие результаты, поскольку препараты иммобилизованных ферментов, приготовленные с помощью хитозана, обладают высокой каталитической активностью и устойчивы к микробному воздействию.

Декстран - разветвленный полисахарид бактериального происхождения, содержащий остатки глюкозы. Приготовленные на его основе гели выпускаются различными зарубежными фирмами и широко используются в различного рода работах, Некоторые из них известны под названием "сефадекс" (Швеция) и "молселект" (Венгрия).

Гели, приготовленные на основе декстрана, отличаются высокой стойкостью по отношению к различным химическим веществам, что делает их весьма широко используемыми в различного рода исследованиях и на производстве. К группе декстранов может быть отнесен и крахмал, представляющий собой смесь полисахаридов, основным компонентом которой является амилоза и амилопектин. Посредством определенных химических обработок из крахмала получен новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к ферментам, гидролизующим полисахариды.

Агароза - широко используется в качестве носителя для иммобилизации ферментов, однако стоимость ее довольно высока, что заставляет разрабатывать различные ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм, которые в результате этого могли бы использоваться повторно. Гели, приготавливаемые на основе агарозы,

выпускаются различными зарубежными фирмами и некоторые широко известны и у нас в стране, например "сефароза".

Агар - природный полисахарид, выделяемый из клеточных стенок некоторых морских водорослей. Точный состав его не известен, но установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин. Преимуществом агара является его низкая стоимость и нетоксичность. Некоторые производные агара отличаются высокой механической прочностью и устойчивостью в щелочной среде, что явилось основанием рассматривать данный носитель почти идеальным.

Другими полисахаридами, получаемыми из морских водорослей, являются альгиновые кислоты и их соли, которые после некоторой модификации применяются для иммобилизации ферментов, клеток и клеточных орган ел л.

Гепарин - кислый полисахарид, успешно применяемый для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в медицине.

Синтетические полимерные носители

Огромное разнообразие синтетических полимеров обеспечивает их широкое использование в качестве носителей для иммобилизации ферментов. Синтетические полимеры используются для иммобилизации ферментов различными способами, а также для получения гелей и микрокапсул

Полимеры на основе стирола

Полимеры этого типа являются основой для изготовления ионообменных материалов, а также для изготовления микропористых и макропористых материалов, используемых в сорбционной иммобилизации.

Полимеры на основе производных акриловой кислоты

Одним из производных акриловой кислоты, широко применяемым в качестве носителя, является акриламид. Весьма широко применяется метод иммобилизации ферментов и клеток путем включения их в полиакриламидный гель (ПААГ). При этом процентное содержание полимера определяет пористость и жесткость геля. Некоторыми фирмами выпускаются носители смешанного типа, изготавливаемые па основе ПААГ и агарозы.

Полиамидные носители

Это группа различных полимеров с повторяющейся амидной группировкой. Главным достоинством носителей этого типа является то, что они могут быть созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т. п. Широкое применение таких носителей, особенно для медицинских целей, обусловлено и биологической инертностью, и стойкостью к воздействию биологических факторов.

В Европе для приготовления полусинтетического пенициллина используется на одном из этапов 6-амино-пенициллиновая кислота, получаемая с помощью иммобилизованного фермента пенициллинацилазы. В год производится примерно 3500 т этой кислоты, а для этого требуется произвести около 30 т указанного фермента.

Иммобилизованная глюкозоизомераза используется в США, Японии и Европе для промышленного производства концентрированного фруктозного сиропа путем частичной изомеризации глюкозы, получаемой из крахмала. Миллионы тонн такого сиропа ежегодно выпускаются с помощью этого фермента, который в настоящее время является наиболее широко применяемым из всех иммобилизованных ферментов.

Промышленные и коммерческие успехи этого процесса определяются следующими факторами: глюкоза, получаемая из крахмала, относительно дешевая; фруктоза — более сладкая, чем глюкоза; концентрированный фруктозный сироп содержит примерно одинаковые количества глюкозы и фруктозы, а по сладости подобен сахарозе.

Другой важной областью применения иммобилизованных ферментов является производство аминокислот с помощью аминоацилазы. Колонки с аминоацилазой используются в Японии для производства сотен килограммов L-метионина, L-фенилаланина, L-триптофана и L-валина. Ферментно-полимерные коньюгаты широко используются в аналитической и клинической химии. Иммобилизованные на колонках ферменты могут использоваться повторно в качестве специфических катализаторов при определении различных субстратов. Например, разработаны ферментные электроды для потенциометрических и амперометрических определений таких веществ, как мочевина, аминокислоты, глюкоза, спирт и молочная кислота.

Дата добавления: 2014-01-04